Определение иммунной системы подавления по сравнению защиты ЦНС для фармакологических вмешательств в аутоиммунного демиелинизации

Общая цель данного концептуального метода состоит в том, чтобы определить, демонстрируют ли фармакологические методы лечения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита защиту центральной нервной системы во время наступления инфильтрации иммунных клеток или как следствие подавления инфильтрации иммунных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроиммунологии. Например, как манипулирование временем лечения ЭАЭ дифференцирует влияние на инфильтрацию иммунных клеток и защиту.

Применение этого метода также распространяется на терапию рассеянного склероза, поскольку в настоящее время не существует нейрозащитных методов лечения этого заболевания. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы обнаружили, что лечение мышей EAE ингибитором системы Xc-транспортер является как нейропротекторным, так и иммуномодулирующим. Хотя этот метод может быть использован для изучения медикаментозного лечения, он также может быть применен к исследованиям с использованием генетических нокаутных мышей, подвергшихся EAE или другим манипуляциям.

Начните с использования стерильных ножниц, чтобы измельчить головной и спинной мозг отдельных животных на мелкие кусочки. Затем используйте один трехмиллилитровый поршень шприца для каждой ткани, чтобы размять каждый образец на отдельных 70-микронных клеточных фильтрах в отдельных 50-миллилитровых конических пробирках, промывая фильтры средой. Когда все кусочки будут мацерированы, доведите окончательный объем в пробирках до 50 миллилитров со свежей средой, после чего центрифугируйте клеточные суспензии.

Повторно суспендируйте каждую гранулу в четырех миллилитрах градиентного раствора плотности 40%. Затем осторожно нанесите медленный слой на стенки отдельных 15-миллилитровых конических пробирок поверх двух миллилитров градиентного раствора 70% плотности на пробирку. Разделите клетки центрифугированием и с помощью одного миллилитра трансферных пипеток тщательно удалите верхние слои миелина.

Затем перенесите жизнеспособные клетки из границ раздела образцов в новые конические пробирки объемом 15 миллилитров и промойте клетки в окончательном объеме 15 миллилитров свежей среды на пробирку. Повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах свежей среды и перенесите клеточные суспензии в отдельные лунки 96-луночной круглой нижней пластины. Центрифугируйте планшет и стряхните надосадочную жидкость.

Затем повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах рестимулирующей среды и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. По окончании инкубации снова центрифугируйте планшет и удалите надосадочную жидкость. Затем промойте клетки в 200 микролитрах PBS с добавлением 2% FCS и повторно суспендируйте клетки в 200 микролитрах PBS с добавлением 2% FCS и FC-блоком на 10-15 минут на льду.

В конце инкубации промойте клетки, как только что продемонстрировано, и повторно суспендируйте гранулы в 15 микролитрах коктейля для окрашивания клеточной поверхности в течение 15 минут на льду. Затем раскрутите клетки и промойте образцы два раза в 200 микролитрах PBS. Затем ресуспендируйте клетки в реагентах, окрашивающих транскрипционный фактор FOXP3 в соответствии с инструкциями производителя, на 30 минут до ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

В конце инкубации промойте клетки в 150 микролитрах буфера для пермеабилизации. Затем центрифугируют клетки и ресуспендируют гранулы во внутриклеточных антителах, представляющих интерес, в 15 микролитрах пермеабилизационного буфера на льду. Через 30 минут поверните клетки вниз, а затем три промывки в 200 микролитрах буфера для проникновения.

После последней промывки ресуспендировать гранулы в 200 микролитрах PBS и проанализировать образцы с помощью проточной цитометрии, затравливая живые CD4-положительные, TCR бета-положительные клетки. Также важно оценить пролиферацию периферических Т-клеток, потому что изменения на периферии могут повлиять на инфильтрацию иммунных клеток в ЦНС. Чтобы количественно оценить количество астроцитов и глиальных клеток, присутствующих в образцах ткани спинного мозга после индукции ЭАЭ, получите изображения каждого участка с 4-кратным увеличением и сохраните изображения в виде файлов TIFF.

Затем в окне ImageJ выберите интересующее вас изображение и с помощью инструмента выделения многоугольников обведите весь участок спинномозговой ткани. В меню изображения выберите тип и 16-бит, чтобы преобразовать изображение в 16-битное. Затем откройте меню процесса и выберите фон объекта, чтобы установить радиус катящегося шара как минимум на размер самого большого объекта, который не является частью фона.

Проверьте скользящий параболоид и нажмите OK. Затем под изображением выберите «Настройка» и «Порог», а затем с помощью ползунков установите нижний пороговый уровень. Чтобы получить процент пороговой площади в пределах выбранной области, в разделе Анализ и установка измерений выберите долю площади. Убедитесь, что предел порогового значения не отмечен и что отображаемая этикетка отмечена, и нажмите OK.To получения измерений, в разделе Анализ выберите Измерение.

Появится всплывающее окно с результатами. Сохраните эти данные и сравните значения долей площади между группами обработки. Чтобы количественно оценить основное окрашивание миелина по оптической плотности, откройте интересующее изображение и с помощью инструмента Полигональные сечения нарисуйте интересующую область в образце.

В разделе Анализ и настройка измерений выберите среднее значение серого и убедитесь, что предел порогового значения не отмечен, а отображаемая метка отмечена. Нажмите OK. Затем в меню анализа выберите пункт Измерить. Появится новое всплывающее окно с результатами с данными о среднем сером значении основного белка миелина.

Удаление спинного мозга и проточный цитометрический анализ позволяют оценить инфильтрацию иммунных клеток центральной нервной системы, где инфильтрация иммунных клеток максимальна на пике заболевания. Статистический анализ числа CD4-положительных, интерферонов-гамма-положительных, IL-17-положительных и FOXP3-положительных клеток может выявить значимость изменений, наблюдаемых в количестве CD4-положительных инфильтрирующих Т-клеток у животных, получавших лекарственные препараты, по сравнению с контрольными животными, с углубленным анализом коэкспрессии, необходимым для исключения искажения как искажающего фактора в общем снижении числа CD4-положительных инфильтрирующих Т-клеток. Чтобы исключить возможность того, что снижение инфильтрации Т-клеток в центральную нервную систему является следствием ингибирования пролиферации, активации и дифференцировки на периферии, можно оценить количество активно пролиферирующих Т-клеток и долю подтипов Т-клеток.

Для количественной оценки целостности миелина можно провести статистический анализ оптической плотности окрашивания основного белка миелина, выявив значительную демиелинизацию ткани спинного мозга у животных с неуточненным генетическим нокаутом по сравнению, например, с однопометниками дикого типа. Чтобы еще больше обосновать, что нейровоспаление поддерживается или уменьшается при терапевтических вмешательствах, реактивный глиоз также может быть оценен путем измерения средней площади фракции для реактивного глиоза, как показано выше. После освоения метод проточной цитометрии может быть завершен за два дня, если он выполнен правильно, в то время как количественная оценка окрашивания тканей может быть выполнена примерно за два часа для каждого окрашивания.

Иммуномодуляцию можно оценить путем введения методов лечения до инфильтрации иммунных клеток для количественной оценки миграционных и пролиферативных изменений в Т-клетках. Защиту ЦНС можно оценить, проводя лечение на пике заболевания, когда иммунные клетки уже проникли в ЦНС. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что необходимо оценить оптимальные пороговые настройки в ImageJ только для конкретного выделения клеточного окрашивания.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как оценить влияние конкретных методов лечения на центральную нервную систему, пролиферацию Т-клеток и миграционные реакции. За счет изменения времени лечения до и после инфильтрации иммунных клеток.