Комплементация сплайсинговой активности комплексом Галектин-3 - U1 snRNP на бусинах

В этом отчете представлены экспериментальные доказательства того, что комплекс галектин-3 U1 snRNP связывается с субстратом премРНК, образует функциональный комплекс и приводит к продуктам реакции сплайсинга. В этом протоколе используется иммуноселекция галектина-3 U1 snRNP на шариках, ковалентно связанных с антителами против gal3, чтобы инициировать реакцию сплайсинга, которая может прогрессировать до завершения. Важнейшим этапом протокола является тщательное удаление жидкости после гранулирования гранул, содержащих комплекс галектин-3 U1 snRNP, и ее немедленное использование для инициирования реакции сплайсинга.

Чтобы истощить U1 snRNP из ядерного экстракта, инкубируйте 200 микролитров ядерного экстракта со 100 микролитрами анти-U1 гранул. Добавьте в смесь пять микролитров РНК и вращайте микротрубку головкой над хвостом при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа. Гранулируйте смесь центрифугированием и соберите несвязанный материал с помощью шприца Hamilton.

Диализовать весь объем U1-обедненного ядерного экстракта вместе с отдельной аликвотой 50 мкл исходного необедненного ядерного экстракта в отдельных отсеках микродиализатора с перемешиванием в течение 75 минут против 60% буфера D при четырех градусах Цельсия. Используйте диализную мембрану с отрезанной молекулярной массой 8K. Сразу после диализа разделите препараты на 20 микролитров аликвот, затем заморозьте их в этаноловой ванне с сухим льдом и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Непосредственно перед использованием дважды промойте шарики anti-gal3 0,5 миллилитрами буфера для промывки TX. Для каждой промывки добавляйте буфер для промывки и центрифугу. Удалите надосадочную жидкость сначала с помощью микропипетки, а затем с помощью шприца Hamilton, чтобы удалить жидкость из шариков.

Фракционируйте ядерный экстракт по градиенту глицерина от 12% до 32%. Соедините и смешайте третью, четвертую и пятую фракции глицеринового градиента, которые находятся вблизи области 10S. Приготовьте две аликвоты по 150 микролитров комбинированных градиентных фракций от трех до пяти и поместите их в 50 микролитров бусин анти-gal3.

Параллельно подготовьте два образца по 150 микролитров первой фракции каждый и поместите их в 50 микролитров гранул анти-gal3. В качестве контроля поместите 150 микролитров 60% буфера D в 50 микролитров гранул анти-Gal3. Аккуратно перемешайте, постукивая по трубкам, затем вращайте их головой над хвостом при температуре четыре градуса Цельсия в течение часа.

Гранулируйте образцы с помощью щадящего центрифугирования. Удалите большую часть надосадочной жидкости с помощью микропипетки. Удалите надосадочную жидкость с помощью шприца Гамильтона, осторожно вставив кончик иглы в нижнюю часть бусин.

Используйте бусины сразу для реакции сращивания. Соберите реакцию сращивания, как описано в текстовой рукописи, и добавьте ее к одному набору образцов бусин. Соберите идентичный набор реакций сплайсинга общим объемом 24 микролитра, но без истощенного U1-истощенного ядерного экстракта и добавьте его к другому набору шариков.

Приготовьте реакцию контрольного сращивания, которую следует проводить при отсутствии каких-либо гранул в общем объеме 12 мкл. Эта контрольная реакция содержит ядерный экстракт, 60% буфер D и радиоактивный субстрат для сплайсера. Осторожно перемешайте пробирки постукивающими движениями и вращайте их головой над хвостом при температуре 30 градусов Цельсия в течение 90 минут, затем измельчите смесь с помощью щадящего центрифугирования.

Остановите реакцию и вымывайте белки из гранул, добавив 24 микролитра буфера для образца 2X SDS в пробирки, содержащие шарики, и 12 микролитров буфера для образца 2X SDS в контрольную трубку, содержащую ядерный экстракт, но без гранул. Закрутите каждую трубку. Нагревайте трубки до 100 градусов Цельсия в течение семи минут.

Центрифугируйте пробирки при перегрузке в 1000 раз G в роторе с качающимся ведром при комнатной температуре в течение 10-15 секунд. Перенесите надосадочную жидкость в свежие микропробирки. Добавьте 20 миллиграммов на миллилитр протеиназы К для переваривания и растворения белков.

Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут. После инкубации аккуратно центрифугируйте пробирки. Разбавьте шарики 39,5 микролитрами TE и 10 микролитрами ацетата натрия трех моляров.

Разбавьте контроль ядерного экстракта 63,5 микролитрами TE и 10 микролитрами ацетата натрия. Извлеките и проанализируйте РНК, как описано в рукописи текста. Ядерные экстракты, обедненные комплексами U1 snRNP и gal3 U1 snRNP из 10S области глицеринового градиента, иммунопреципитированного анти-gal3, смешивали в реакции сплайсинга.

Эта реакционная смесь содержала U1 snРНК, а также U1 специфический белок U1-70K. Как и ожидалось, анти-gal3 выпал в осадок gal3. U1 snRNA, белок U1-70K и gal3 не были обнаружены в преципитации преиммунного контроля.

По сравнению с необедненным ядерным экстрактом, проводимым в качестве положительного контроля, ядерный экстракт, обедненный U1 snRNP, не проявлял активности сплайсинга. Активность сплайсинга в обеднённом U1 ядерном экстракте может быть восстановлена связанным с гранулами комплексом snRNP gal3 U1. Обнаружены оба продукта реакции сплайсинга: лигированные экзоны и иссеченный интронлариат, а также в промежуточных продуктах.

Компоненты фракций с третьей по пятую сыграли решающую роль в восстановлении сплайсинга на истощенном U1 ядерном экстракте. Когда эти фракции были заменены только буфером, активность сплайсинга наблюдаться не удалась, что указывает на то, что анти-Gal3 гранулы не были ответственны за восстановление активности сплайсинга в ядерном экстракте, обеднённом U1. Более убедительно то, что когда фракции с третьей по пятую были заменены на фракцию 1 в процедуре иммунопреципитации, а затем добавлены к истощенному U1 ядерному экстракту, не было обнаружено никаких промежуточных продуктов или продуктов реакции сплайсинга. При использовании этого протокола один человек должен завершить иммунопреципитацию, в то время как другой человек готовит реакцию сплайсинга с как можно меньшей задержкой.

Большой интерес представляет протеомный анализ полипептидного состава галектина-3 U1 SNRP, который восстанавливает активность сплайсинга в истощенном U1 ядерном экстракте.