Слияние абсолютной и относительной количественной ПЦР данных для количественного определения Stat3 сплайсированный вариант Transcripts
9 октября 2016 г.
События тандемного сплайсинга происходят в сайтах, отстоящих друг от друга менее чем на 12 нуклеотидов. Количественная оценка соотношений таких вариантов сплайсинга возможна с использованием метода абсолютной количественной ПЦР. В данной рукописи описывается, как можно количественно оценить варианты сплайсинга гена STAT3, в которых два события сплайсинга приводят к включению/исключению Serine-701 и α/β C-концов.
Общая цель этого протокола заключается в количественной оценке пропорций и абсолютных уровней транскриптов вариантов сплайсинга STAT3 в эозинофилах. Этот метод может решить ключевые вопросы в области регуляции сплайсинга, такие как коассоциация событий дистального сплайсинга и идентификация условий, которые могут привести к изменению пропорций тандемного сплайсинга. Основным преимуществом этого метода является наличие плазмидных стандартов, позволяющих получать абсолютные и относительные данные количественной ПЦР, что позволяет определить пропорции и общие уровни четырех транскриптов STAT3.
В нашем случае мы хотим узнать, как изменяются четыре варианта STAT3 S альфа, S бета, дельта S альфа и дельта S бета при стимуляции эозинофилов цитокинами. Хотя этот метод может дать представление о составе эозинофила STAT3, он также может быть применен к другим типам клеток, для которых может быть получена кДНК. Поскольку S и дельта S варьируются только в трех нуклеотидах, нам пришлось пожертвовать эффективностью, чтобы достичь специфичности в стандартах для каждого варианта.
В этом протоколе кДНК, полученная из эозинофилов человека, используется в качестве матрицы для амплификации вариантов сплайсинга STAT3. После создания плазмид, как описано в текстовом протоколе, подготовьте реакции секвенирования для секвенирования плазмид из нескольких колоний. Каждая реакция объемом 20 микролитров должна содержать три микролитра реакционного буфера для секвенирования, два микролитра реакционной смеси для секвенирования, 12 микролитров сверхчистой воды, один микролитр плазмиды и два микролитра праймера для секвенирования.
Когда доступны результаты секвенирования, оцените электрофоретограммы плазмид, кодирующих каждый вариант; S альфа, S бета, дельта S альфа и дельта S бета. Измерьте концентрацию чистой плазмидной ДНК в нанограммах на микролитр и рассчитайте количество копий на микролитр. Начните эту процедуру с приготовления серии разведения плазмид STAT3 один к 10 с использованием сверхчистой воды.
С примерно 10 на восьмую до 10 на треть копий на микролитр. Измерьте концентрацию наиболее концентрированного образца. Используйте разведенные плазмиды для приготовления четырех нецелевых смесей в качестве отрицательного контроля для каждого варианта сплайсинга в соотношении от 10 до шестой копий на микролитр для каждого варианта.
Приготовьте целевую смесь с равными концентрациями всех четырех шаблонов, каждая из расчета от 10 до шестой копий на микролитр. Приготовьте растворы пар праймеров для каждого варианта сплайсинга с 60 микролитрами праймеров, каждый с концентрацией 7 микромоляров, для получения конечной концентрации 560 наномоляров в образце. Разбавьте ДНК-полимеразу, двухцепочечную смесь красителей, связывающих ДНК, от семи до пяти с чистой водой.
Установите анализ в 96-луночный ПЦР-планшет по этому шаблону. Сначала добавьте в каждую лунку по 21 микролитру разведенной ДНК-полимеразы, двухцепочечной смеси красителя, связывающего ДНК. Затем добавьте два микролитра грунтовочной смеси и два микролитра шаблона.
В каждую нешаблонную контрольную скважину добавьте два микролитра фильтрованной воды вместо шаблона. Настройте реакции в двух экземплярах, чтобы оценить повторяемость. Запечатайте планшет для количественной ПЦР клейкой крышкой и центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 1 200 г при 12 градусах Цельсия.
Включите аппарат для количественной ПЦР и вставьте запечатанную пластину для количественной ПЦР. Если вы используете систему ПЦР в реальном времени ABI, настройте эксперимент так, как показано на рисунке. Нажмите «Файл», «Создать», «Далее», выберите «Новый детектор», затем укажите имя и выберите «Репортер» и «Гаситель».
Настройте новый детектор для каждого варианта сращивания. Нажмите кнопку Далее и настройте стандарты, как указано на странице Настройка образца пластины, убедившись, что величины введены в таблицу и выбраны соответствующие детекторы. Нажмите кнопку Готово.
Настройте соответствующую программу циклирования ПЦР. Убедитесь, что показания флуоресценции для определения пороговых значений цикла происходят в течение 72 градусов Цельсия каждого цикла. Выберите «Выполнить».
Когда прогон будет завершен, перейдите на вкладку Результаты (Results) Диаграмма Усиление (Amplification Plot). Оцените график Output Amplification (Выходное усиление) для оценки качества данных. Экспоненциальный график указывает на надежное усиление.
Экспортируйте результаты в программу для работы с электронными таблицами. Анализ данных, как описано в текстовом протоколе, является ключом к пониманию того, требует ли анализ дальнейшей оптимизации ради воспроизводимости. КДНК для этого анализа получают из эозинофилов, обработанных цитокинами для стимуляции транскрипции.
Готовят серийные разведения двух образцов аликвот кДНК с диапазоном разведения от одного до одного к 1,024. Проводите анализ в 96-луночном планшете с реакциями объемом 25 микролитров, как показано для анализа специфичности праймера, но с несколькими концентрациями праймера для pan STAT3 и домашнего гена GUSB. Шаблон приведен в этой таблице.
Вставьте запечатанную ПЦР-планшет в аппарат для количественной ПЦР. Настройте эксперимент с помощью программного обеспечения, добавив новый детектор для GUSB и используя соответствующую программу циклирования ПЦР. Впоследствии результаты используются для вычисления порогового значения цикла для каждой выборки, как описано в текстовом протоколе.
Чтобы начать эту процедуру, сравните пороговые значения цикла, полученные в относительной кПЦР для домашнего гена GUSB, и соответственно разбавьте кДНК сверхчистой водой, чтобы убедиться, что все концентрации находятся в пределах одного порядка. Настройте абсолютный анализ количественной ПЦР образцов в 96-луночных планшетах. Следуйте этому шаблону для S alpha и S beta и этому шаблону для delta S alpha и delta S beta.
Проведите анализы, как показано ранее, и повторите их, по крайней мере, один раз. Затем настройте 96-луночный планшет для абсолютной количественной ПЦР с реакцией 25 микролитров с использованием праймеров STAT3 на 400 микромолях и смеси всех четырех плазмид или одной плазмиды по этому шаблону. Запечатайте планшет для количественной ПЦР клейкой крышкой и центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 1 200 г при 12 градусах Цельсия.
Вставьте герметичную ПЦР-планшет в машину для количественной ПЦР и настройте эксперимент, как показано ранее, добавив новый детектор для pan STAT3. Настройте те же параметры циклирования, что и для относительной количественной ПЦР. После повторения анализа хотя бы один раз проанализируйте результаты, как описано в текстовом протоколе.
Данные кПЦР хорошего качества позволят получить график сигмоидальной ампликации, означающий экспоненциальное увеличение транскриптов в ходе циклирования. Эти данные были получены с помощью количественной ПЦР двух серийных разведений плазмиды, содержащей STAT3 S альфа. Каждая пара цветных линий представляет уровни флуоресценции дубликатов разбавленных образцов в течение 40 циклов.
Стандартные кривые, построенные для плазмид калибратора шаблонов, будут указывать на эффективность усиления. На этой кривой для STAT3 S альфа эффективность амплификации составила 83,9%. Для оценки конгруэнтности уровней STAT3 были измерены абсолютные значения каждого из четырех вариантов сплайсинга, а также уровень общего STAT3. В идеале и линейная регрессия, и наклон должны быть близки к единице.
Абсолютные данные количественной ПЦР представлены в виде круговых диаграмм, показывающих их доли четырех вариантов сплайсинга STAT3 в течение курса лечения цитокинами. Объединение абсолютных и относительных данных количественной ПЦР показало, что уровни всех вариантов сплайсинга STAT3 увеличивались после стимуляции цитокинами IL3 и TNF альфа, достигая пика через шесть часов. Объединение данных со всех временных точек выявило небольшое, но значимое смещение в сторону коассоциации событий бета- и дельта-S-сплайсинга.
После оптимизации анализы, основанные на этой методике, могут быть выполнены за четыре часа при правильном выполнении. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о работе в стерильных условиях, чтобы предотвратить загрязнение. Решения о сплайсинге, которые включают или исключают один кодон, составляют 20% вариации сплайсинга в кадре.
Наш протокол должен быть легко адаптируемым к количественной оценке таких вариаций. После его разработки этот метод позволил Мао Чжану работать с моей группой в группе Ли-Шань Рю для контроля экспериментов по реэкспрессии нокдауна вариантов STAT3 в клетках лимфомы ABC. Эти эксперименты показали, что для выживания клеток в культуре требуется сочетание вариантов S и дельта S.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить абсолютную и относительную кПЦР, а также об условиях, подходящих для различения и количественной оценки тонких различий в сплайсинге.
Обзор
Это исследование представляет метод для количественной оценки пропорций и абсолютных уровней транскриптов сплайсовых вариантов STAT3 в эозинофилы. Протокол использует абсолютное количественное ПЦР для анализа сплайсовых вариантов, полученных в результате тандемовых сплайсинговых событий.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Молекулярная биология
Предыстория
- Тандемовые сплайсинговые события происходят на участках, расположенных на расстоянии менее 12 нуклеотидов.
- Количественная оценка сплайсовых вариантов необходима для понимания регулирования генов.
- Сплайсовые варианты STAT3 включают S alpha, S beta, delta S alpha и delta S beta.
- Понимание этих вариантов может дать представление об эозинофилы функции и ответе на цитокины.
Цель исследования
- Количественная оценка уровней сплайсовых вариантов STAT3 в эозинофилы.
- Исследование того, как стимулирование цитокинами влияет на экспрессию этих вариантов.
- Предоставление надежного метода для оценки пропорций сплайсовых вариантов.
Используемые методы
- Подготовка комплементарной ДНК из человеческих эозинофилов.
- Использование плазмидных стандартов для абсолютного и относительного получения данных qPCR.
- Реакции секвенирования для оценки плазмидных конструкций для каждого сплайсового варианта.
- Настройка qPCR анализов в формате на 96 лунок для анализа уровней транскриптов.
Основные результаты
- Успешная количественная оценка четырех сплайсовых вариантов STAT3.
- Демонстрированные изменения в уровнях сплайсовых вариантов при стимулировании цитокинами.
- Предоставлен метод, применимый для различных типов клеток для анализа сплайсовых вариантов.
- Данные указывали на необходимость оптимизации воспроизводимости анализа.
Выводы
- Метод эффективно количественно оценивает сплайсовые варианты STAT3 в эозинофилы.
- Полученные знания могут улучшить понимание регулирования сплайсинга.
- Этот подход может быть адаптирован для других типов клеток и условий.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of splice variant proportions enables mechanistic de-risking in target validation by resolving transcriptional heterogeneity that can confound functional assays. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking isoform-specific expression to phenotypic outcomes in disease-relevant systems. The method’s adaptability to tandem splicing sites offers a scalable strategy for early discovery workflows where subtle transcriptional changes inform go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by quantifying isoform-specific expression changes in response to cytokine stimulation.
- Operational Value: Provides absolute quantification via plasmid standards, reducing reliance on comparative methods that may introduce normalization bias.
- Predictive Value: Supports assessment of co-splicing interdependence, aiding in the prioritization of targets with coordinated regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducibility-ready data for four highly similar splice variants, enabling precise discrimination in multiplexed assays.
- Operational Value: Establishes standardized workflows using calibrated plasmid dilutions, facilitating cross-lab consistency in transcript quantification.
- Scalability: Compatible with 96-well qPCR formats, allowing medium-throughput screening of splice variant dynamics under experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links eosinophil STAT3 isoform shifts to cytokine exposure, providing a disease-relevant system for inflammatory pathway analysis.
- Mechanistic De-risking: Reveals co-splicing patterns between distal tandem sites, informing biomarker strategies that account for coordinated transcriptional regulation.
- Preclinical Model Relevance: Demonstrated adaptability to lymphoma cells, supporting cross-system validation of splice variant functional roles.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by delivering absolute and relative transcript data that inform both target validation and assay readiness stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splicing regulation by quantifying isoform-specific responses to stimuli, clarifying pathway-level effects.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs from absolute qPCR, enabling reliable comparison of splice variant proportions across conditions.
- Analytics: Combines absolute quantification with efficiency-corrected relative qPCR to derive both proportional and total transcript levels, enhancing data interpretability.
- Translational Research: Connects isoform dynamics in primary eosinophils to preclinical models, supporting continuity in target validation.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based standardization allows the assay to be reused across projects and cell types as a plug-and-play quantification module.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific expression, improving target confidence in STAT3-related pathways.
- Operational Value: Ensures reproducibility through plasmid standard curves and optimized cycling parameters, minimizing inter-assay variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking splice variant ratios to functional outcomes in cellular models.
- Portfolio Impact: Enables data-driven triage of targets based on isoform expression stability and co-splicing behavior under pathophysiological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR optimization, plasmid preparation, and sequence validation to ensure splice variant specificity.
- Dependent on access to qPCR instrumentation with fluorescence detection and thermal cycling precision for accurate threshold cycle determination.
- Necessitates cross-team standardization of plasmid dilution series and primer concentration protocols to maintain assay comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to new cell types, including cDNA quality and transcript abundance thresholds.
- Practical limitation: Primer specificity must be balanced with amplification efficiency due to minimal nucleotide differences between variants, as noted in the protocol optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Creating Plasmids as Template Standards
2:20
Analyzing Primer Specificity for Absolute qPCR
5:49
Performing Relative qPCR Assays
6:57
Analyzing Absolute qPCR Data for Unknown Samples
8:27
Results: Measurement of STAT3 Splice Variant Levels in Eosinophils Treated with Cytokines
10:06
Conclusion
