Слияние абсолютной и относительной количественной ПЦР данных для количественного определения Stat3 сплайсированный вариант Transcripts

Общая цель данного протокола заключается в количественном определении пропорций и абсолютных уровней транскриптов сплайс-вариантов STAT3 в эозинофилах. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области регуляции сплайсинга, такие как коассоциация дистальных событий сплайсинга и идентификация условий, которые могут привести к изменению пропорций тандемного сплайсинга. Основным преимуществом данного метода является использование плазмидных стандартов, позволяющих получать абсолютные и относительные данные qPCR для определения пропорций и общего уровня четырех транскриптов STAT3.

В нашем случае мы стремимся выяснить, как изменяется экспрессия четырех вариантов STAT3 — S alpha, S beta, delta S alpha и delta S beta — при стимуляции эозинофилов цитокинами. Хотя данный метод позволяет получить представление о составе STAT3 в эозинофилах, его также можно применять к другим типам клеток, из которых можно выделить кДНК. Поскольку варианты S и delta S различаются всего тремя нуклеотидами, нам пришлось пожертвовать эффективностью ради достижения специфичности при использовании стандартов для каждого варианта.

В данном протоколе кДНК, выделенная из эозинофилов человека, используется в качестве матрицы для амплификации сплайс-вариантов STAT3. После создания плазмид, как описано в текстовом протоколе, подготовьте реакции для секвенирования плазмид из нескольких колоний. Каждая реакция объемом 20 µL должна содержать 3 µL буфера для реакции секвенирования, 2 µL смеси для реакции секвенирования, 12 µL ультрачистой воды, 1 µL плазмиды и 2 µL праймера для секвенирования.

После получения результатов секвенирования проанализируйте электрофоретограммы плазмид, кодирующих каждый вариант: S alpha, S beta, delta S alpha и delta S beta. Измерьте концентрацию чистой плазмидной ДНК в нанограммах на микролитр и рассчитайте число копий на микролитр. Начните выполнение данной процедуры с приготовления серии десятикратных разведений плазмид STAT3 с использованием ультрачистой воды.

При концентрации примерно от 10⁸ до 10³ копий на микролитр. Измерьте концентрацию наиболее концентрированного образца. Используйте разведенные плазмиды для приготовления четырех нецелевых смесей в качестве отрицательных контролей для каждого варианта сплайсинга в концентрации 10⁶ копий на микролитр для каждого варианта.

Приготовьте смесь мишеней с равными концентрациями всех четырех шаблонов, по 10⁶ копий на микролитр каждого. Приготовьте растворы пар праймеров для каждого сплайс-варианта, используя 60 мкл праймеров с концентрацией каждого 7 мкМ, чтобы конечная концентрация в образце составила 560 нМ. Разведите ДНК-полимеразу и смесь красителя для связывания с двухцепочечной ДНК в пропорции 7:5 чистой водой.

Подготовьте анализ в 96-луночном ПЦР-планшете согласно данному шаблону. Сначала добавьте в каждую лунку 21 µL разведенной ДНК-полимеразы и смеси красителя, связывающегося с двухцепочечной ДНК. Затем добавьте две µL смеси праймеров и две µL матрицы.

В каждую лунку отрицательного контроля (без матрицы) вместо матрицы добавьте два µL фильтрованной воды. Поставьте реакции в двух повторах для оценки воспроизводимости. Заклейте планшет для qPCR адгезивной крышкой и центрифугируйте в течение пяти минут при 1 200 g и 12 °C.

Включите прибор для qPCR и вставьте запечатанный планшет для qPCR. При использовании системы ПЦР в реальном времени ABI настройте эксперимент, как показано на видео. Нажмите File, New, Next, выберите новый Detector, затем укажите название и выберите Reporter и Quencher.

Настройте новый детектор для каждого варианта сплайсинга. Выберите «Next» и настройте стандарты, следуя инструкциям на странице «Set Up Sample Plate», убедившись, что в таблицу введены соответствующие количества и выбраны нужные детекторы. Нажмите «Finish».

Настройте соответствующую программу циклов ПЦР. Убедитесь, что считывание флуоресценции для определения значений порогового цикла происходит на этапе 72 °C каждого цикла. Выберите Run.

По завершении запуска перейдите на вкладку Results, затем на вкладку Amplification Plot. Оцените график амплификации (Output Amplification plot) для анализа качества данных. Экспоненциальный характер графика свидетельствует о надежной амплификации.

Экспортируйте результаты в программу для работы с электронными таблицами. Анализ данных, описанный в текстовом протоколе, имеет ключевое значение для определения того, требуется ли дальнейшая оптимизация анализа для обеспечения воспроизводимости. кДНК для данного анализа подготавливают из эозинофилов, обработанных цитокинами для стимуляции транскрипции.

Подготовьте серийные разведения двух аликвот кДНК образца в диапазоне от 1 до 1:1024. Проведите анализ в 96-луночном планшете с объемом реакции 25 мкл, как показано при анализе специфичности праймеров, но с использованием нескольких концентраций праймеров для pan STAT3 и генного контроля GUSB. Шаблон представлен в данной таблице.

Поместите герметично закрытую ПЦР-пластину в прибор для кПЦР. Настройте эксперимент с помощью программного обеспечения, добавив новый детектор для GUSB и выбрав соответствующую программу циклов ПЦР. Затем полученные результаты используются для расчета значения порогового цикла для каждого образца, как описано в текстовом протоколе.

Для начала данной процедуры сравните значения порогового цикла, полученные в результате относительной qPCR для референсного гена GUSB, и соответствующим образом разведите кДНК ультрачистой водой, чтобы все концентрации находились в пределах одного порядка. Подготовьте планшеты на 96 лунок для проведения абсолютной qPCR образцов. Используйте данный шаблон для S alpha и S beta и этот шаблон для delta S alpha и delta S beta.

Проведите анализы, как было показано ранее, и повторите их как минимум один раз. Затем подготовьте 96-луночный планшет для абсолютной кПЦР с реакциями объемом 25 µL, используя пан-праймеры к STAT3 в концентрации 400 µM и смесь всех четырех плазмид или одну плазмиду согласно данному шаблону. Герметично закройте планшет для кПЦР адгезивной крышкой и центрифугируйте в течение пяти минут при 1 200 g и 12 °C.

Поместите герметично закрытую ПЦР-пластину в прибор для qPCR и настройте эксперимент, как было показано ранее, добавив новый детектор для общего STAT3. Установите те же параметры циклов, что и для относительной qPCR. После повторения анализа как минимум один раз проанализируйте результаты в соответствии с текстовым протоколом.

Высококачественные данные qPCR позволяют получить сигмоидальный график амплификации, свидетельствующий об экспоненциальном увеличении количества транскриптов в ходе циклов. Данные результаты были получены в ходе qPCR двух последовательных разведений плазмиды, содержащей STAT3 S alpha. Каждая пара цветных линий представляет уровни флуоресценции дубликатов разведенных образцов на протяжении 40 циклов.

Стандартные кривые, построенные для калибровочных плазмид-матриц, позволят определить эффективность амплификации. На данной кривой для STAT3 S alpha эффективность амплификации составила 83,9%. Для оценки согласованности уровней STAT3 были измерены абсолютные значения каждого из четырех сплайс-вариантов, а также общий уровень STAT3. В идеале и линейная регрессия, и наклон кривой должны быть близки к единице.

Данные абсолютной qPCR представлены в виде круговых диаграмм для отображения пропорций четырех сплайс-вариантов STAT3 в ходе обработки цитокинами. Объединение данных абсолютной и относительной qPCR показало, что уровни всех сплайс-вариантов STAT3 повышались после стимуляции цитокинами IL3 и TNF alpha, достигнув пика через шесть часов. Объединение данных за все временные точки выявило небольшую, но значимую тенденцию к коассоциации событий сплайсинга beta и delta S.

После оптимизации анализы, основанные на данном методе, могут быть проведены за четыре часа при условии правильного выполнения. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работы в стерильных условиях для предотвращения контаминации. Решения по сплайсингу, включающие или исключающие один кодон, составляют 20% вариаций сплайсинга в одной рамке считывания.

Наш протокол может быть легко адаптирован для количественной оценки таких вариаций. После разработки данного метода Мао Чжан в сотрудничестве с моей группой и группой Ли-Шан Рю проводил эксперименты по контролю реэкспрессии нокдаун-вариантов STAT3 в клетках ABC-лимфомы. Эти эксперименты показали, что для выживания клеток в культуре требуется смесь вариантов S и delta S.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как проводить абсолюльную и относительную кПЦР, а также какие условия необходимы для выявления и количественной оценки незначительных различий в сплайсинге.