Методы подготовки тканей для контрастно-усиленной микрокомпьютерной томографии моделей сердца крупных млекопитающих с хроническими заболеваниями

Этот протокол обеспечивает микроструктурное понимание структурных патологических заболеваний во всем масштабе органа с помощью микрокомпьютерной томографии. В этом протоколе реализован специализированный метод подготовки тканей для оптимизации визуализации с высоким разрешением образцов всего сердца из трансляционных моделей крупных млекопитающих у людей с селективным контрастным усилением структурных заболеваний. Сердечная микроструктура, такая как распределение фиброза и организация возбудимого миокарда, лежит в основе широкого спектра сердечных заболеваний и создает сцену для угрожающей жизни аритмии.

Продемонстрировать процедуру будет Нестор Палларес-Лупон, постдок и аспирант моей лаборатории. Для начала приготовьте кардиоплегический раствор, содержащий гепарин натрия и храните раствор при четырех градусах Цельсия. Затем приготовьте PBS/EDTA, сначала добавив ЭДТА к одному литру дистиллированной воды для конечной концентрации 10 миллимоляров.

Затем увеличивают и поддерживают рН раствора на уровне 12, используя гидроксид натрия для растворения ЭДТА. Как только ЭДТА полностью растворится, понизьте рН до 7,4 с помощью соляной кислоты. Затем добавляют один фольгированный мешочек PBS для получения молярного раствора 0,01 с рН 7,4.

Хранить приготовленный раствор при комнатной температуре. Наконец, приготовьте 1%-ный раствор этанолового контрастного вещества PMA, добавив 10 грамм PMA к одному литру абсолютного этанола. Хранить приготовленный раствор при комнатной температуре.

Подготовьте литровый резервуар, поддерживаемый на 80 сантиметров выше тарелки для рассечения, и соедините термопластичную трубку с дренажным отверстием резервуара. Закрепите трехсторонний кран к дренажной трубке и соедините дополнительные термопластичные трубки с каждым свободным портом на трехстороннем кране. Закрепите двухходовые краны на свободных концах трубки.

Далее заполните резервуар кардиоплегическим раствором, дополненным гепарином. Откройте краны, чтобы кардиоплегический раствор слился, удалив все пузырьки воздуха. Затем закройте двухсторонние краны.

После извлечения сердца из усыпленного животного поместите его в холодный кардиоплегический раствор, хранящийся на льду до готовности к рассечению. Затем подготовьте канюлю для левого и правого коронарного остео, разрезав пять сантиметров трубки из PTFE и нагрев один конец, поместив наконечник рядом с голым пламенем. Как только один миллиметр наконечника начнет плавиться и станет полупрозрачным, прижмите наконечник к жесткой термостойкой поверхности, чтобы сформировать гребень на кончике канюли, чтобы предотвратить выскальзывание канюли из сосудов, затем вставьте один сантиметр ненагретого конца каждой канюли в два конца дренажной трубки дренажного резервуара.

Далее удаляют канюлю аорты и локализуют левый и правый остео коронарных артерий под холодным кардиоплегическим раствором. Используя заостренные ножницы, тщательно отделите корень аорты от окружающих тканей выше и ниже коронарного остео, чтобы обеспечить резьбу шелкового шва нулевого калибра под коронарным сосудом. Затем откройте двухсторонние краны и вставьте кончики канюли в коронарную остео.

Когда кончики канюли простираются на один-два сантиметра в остео и за пределы размещения шва, свяжите канюлю. Затем промойте сердце, нежно массируя желудочки в течение 15 минут, пока сердце не очистится от крови. После промывки закройте двухходовые краны, отсоедините их от трехходового крана и перенесите сердце в литровый пластиковый химически стойкий контейнер, содержащий 500 миллилитров раствора PBS/EDTA.

Рециркулируйте раствор PBS/EDTA в термопластичной трубке под вытяжным колпаком с помощью перистальтического насоса с двумя каналами. Загрунтуйте насосную трубку до тех пор, пока в трубке не отсутствуют пузырьки воздуха. Затем просмотрите каждую канюлю коронарной артерии путем рециркуляции при комнатной температуре в течение двух часов со скоростью 80 миллилитров в минуту.

Убедившись, что вытяжной шкаф работоспособен, остановите насос, слейте раствор из контейнера и замените его 10%-ным формалином для фиксации в течение одного часа со скоростью 80 миллилитров в минуту. Просмотрите сердце, используя серию увеличивающихся концентраций этанола, начиная с 20% этанола в течение как минимум трех часов. Затем замените 20%-ный этанол на 30%-ный этанол и перфуйте в течение двух часов.

Продолжайте перфузию, увеличивая концентрацию этанола на каждой итерации с минимальной перфузией в один час при каждой концентрации. Чтобы укрепить сердечную ткань перед высыханием на воздухе, рециркулируйте равную смесь этанола и HMDS в течение 10 минут, а затем 100% HMDS в течение еще двух часов. Остановите перфузионный насос, затем отсоедините канюлю от трубки и подвешивайте сердце от аортального шва внутри вытяжного капота.

Осторожно проведите мешком-молнией по сердцу и закройте уплотнитель пакета поверх шва, чтобы уменьшить воздействие на сердце циркулирующего воздуха. Дайте сердцу высохнуть путем испарения в течение одной недели. Для диффузионной загрузки контрастных веществ снимите мешок.

Промыть сердце 100% этанолом в течение 15 минут с перемешиванием, прежде чем погрузить его в 100% этанол, дополненный 1% PMA в течение 48 часов под вакуумом, затем накройте сердце мешком на молнии, как показано ранее, и дайте ему высохнуть. Установите высушенное на воздухе сердце на соответствующий держатель для образцов. Чтобы предотвратить любое движение во время рентгеновских микро-КТ-измерений, используйте зажим, закрепленный на держателе образца, и закрепите сердце через высушенную и жесткую аорту.

Установите держатель образца в микро-компьютерный томограф. Затем откройте программное обеспечение и запустите рентгеновскую систему микроКТ. Затем установите рентгеновский фильтр алюминиевой на один миллиметр.

Напряжение источника рентгеновского излучения до 60 киловольт и ток до 120 микроампер. Кроме того, задайте размеры изображения 2 016 на 1 344 пикселя, а размер пикселя — 20 микрометров. Разведчик рентгеновских снимков передачи по длине опоры для определения общего поля визуализации в продольном доступе сердца.

Для сканирования используйте шаг поворота на 0,18 градуса, усреднение кадра на пять градусов и поворот образца на 180 градусов, отменив выбор параметра для получения на 360 градусов. Выберите режим сканирования со смещением, чтобы получить изображение всей ширины поддержки образца. После сканирования используйте программное обеспечение для томографической реконструкции изотропного трехмерного объема изображения.

В конечном итоге разведывательное программное обеспечение использует коррекцию артефактов, связанную с получением, включая эффекты упрочнения пучка на 10% и уменьшение кольцевых артефактов на восемь. Затем, используя программное обеспечение Data Viewer, визуализируйте реконструированный стек данных. Цифровая ориентация образца в границах изображения, чтобы перестроить длинную и короткую ось образцов с тремя принципами оси объема изображения.

Наконец, обрежьте объем изображения по всем трем осям, чтобы удалить внешние фоновые слои изображения и максимально уменьшить общий размер изображения. Рентгеновская визуализация высушенных на воздухе сердец свиней показывает основные анатомические ориентиры, включая желудочковые полости и мышечную стенку. Томографические реконструкции объемов трехмерного изображения показали отчетливое разделение между тканью и фоном на эпикардиальных и эндокардиальных границах.

Трихромное окрашивание Мейсона показало коллагеновое положительное окрашивание в эпителиальном и эндотелиальном слоях параваскулярно в субэпикардиальной ткани. Яркое полевое освещение показало более темную окраску в коллагеновых структурах после окрашивания PMA, поддерживая преимущественное накопление PMA. Окрашенные PMA флуоресцентные изображения участков желудочковой ткани имели PMA-индуцированную потерю флуоресценции на участках коллагена.

Если образец сердца окрашивали контрастным веществом посредством перфузии перед сушкой на воздухе, реконструкция изображения выявила очень пятнистое окрашивание в отсеке миокарда. Более того, низкая контрастность тканей показала плохое отделение от интенсивности фона. МикроКТ-томография части овцы, страдающей хроническим инфарктом миокарда, выявила центральное плотное фиброзное поражение, окруженное рыхлой и гетерогенной пограничной зоной.

Здесь показаны наибольшие интенсивности сигналов реконструированных объемов изображения на границах тканей и рубцовых областях. Контрастные вещества плохо окрашивали здоровый миокард, но микроструктурный контраст сохранялся. В пограничной зоне рубцовая ткань перемежалась с выжившим миокардом.

Плотный фиброз оказался трансмуральным, но текстурированным, что указывает на различия в составе. Трансмуральная область левого желудочка препарата окрашенной ткани ПМА показала селективное окрашивание на коллаген и отсутствие окрашивания в областях выжившего миокарда. Более длительное время перфузии с использованием этанола рекомендуется для обеспечения полного обмена содержания воды в сердце с этанолом.

Взаимодействия между HMDS и водой производят тепло, которое может повредить образец. Сильным преимуществом этой процедуры является возможность проверки микро-компьютерной томографии с использованием гистологии. Высушенные на воздухе образцы могут быть непосредственно встроены в парафин для окрашивания сечением и микроскопирования.