Определение распределения гликогена по длине глюкановой цепи методом флуорофорного углеводного электрофореза (FACE)

В настоящем протоколе метод флуорофорно-вспомогательного углеводного электрофореза (FACE) используется для определения распределения длины цепи (CLD) и средней длины цепи (ACL) гликогена.

Этот метод обеспечивает лучшее понимание структурных организаций частиц гликогена. Это важный вопрос, потому что популяция глюкановых цепей, так называемое распределение длины цепи, определяет физико-химические свойства частиц гликогена. Например, растворимость в воде.

Одним из основных преимуществ этого метода является то, что флуоресценция постоянна независимо от длины цепи глюкана. Существует только одна молекула APTS, связанная глюканом. Таким образом, интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна количеству глюкановых цепей.

Поле для вспомогательного капиллярного электрофореза подходит для решения медицинского механизма ферментов, метаболизирующих гликоген. Например, мы можем определить степень полимеризации цепей глюкана, переносимых путем ветвления ферментов на принятый глюкан. Реакцию необходимо проводить в условиях.

Поэтому регионы необходимо защищать от влаги. Смешайте 200 микролитров по 0,5-2 миллиграмма на миллилитр очищенного гликогена с 200 микролитрами 100 ацетатного буфера рН 4,8. Добавьте 2 микролитра изоамилазы и 1,5 микролитра пуллулазы.

Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз. Затем инкубируют при 42 градусах Цельсия в течение 16 часов в 1,5-миллилитровой пробирке. Остановите реакции путем инкубации при 95 градусах Цельсия в течение 5 минут.

Центрифугу в 16, 100 раз G'в течение 5 минут при комнатной температуре до гранулировать и удалить любой нерастворимый материал. Снимите супер обслуживание пипеткой и перенесите их на новые аннотированные трубки. После добавления смоляных шариков в пустую микро-дымоходную трубку обессолить супернатанты, добавив эквивалент 100 микролитров анионно-катионообменных шариков смолы и перемешать.

Соберите образцы путем пипетирования и поместите их в новые аннотированные трубки. Сублимационная сушка образцов. Храните высушенные образцы при комнатной температуре или 20 градусов Цельсия.

Смешайте высушенные образцы с 2 микролитрами 1 молярного цианоборогидрида натрия и тетрагидрофурана и 2 микролитрами 8 аминотрисульфоновой кислоты 1-3-6 пирентрисульфоновой кислоты. Инкубировать при 42 градусах Цельсия в течение 16 часов в темноте. Добавьте 46 микролитров сверхчистой воды в каждый образец.

Чтобы разбавить образцы в 50 раз, добавьте один микролитр образца к 49 микролитрам сверхчистой воды в 100 микролитрах микрочипов. В вихре тщательно перемешать. Поместите образцы в темноту на 5-10 минут во время установки лица.

Чтобы выполнить электрофорез обратной полярности, настройте метод, установите давление впрыска на 0,5 фунт силы на квадратный дюйм. Затем установите полярность в обратный режим для разделения. Разбавьте N-связанный буфер разделения углеводов до одной трети в сверхчистой воде.

Проводят разделение глюканов с маркировкой APTS в разбавленном буфере при 30 киловольтах в голом плавленом капилляре кремнезема. Затем установите время инъекции и начните анализ. Экспортируйте файлы ASC и CDF, содержащие профиль электроферограммы и данные интеграции соответственно.

Откройте файл ASC и нарисуйте относительную флуоресцентную единицу в соответствии с временной диаграммой. Откройте файл CDF. Приступайте к первой автоматической интеграции и корректируйте следующие параметры с интеграцией долины в долину и минимальной площадью.

Проверяйте и исправляйте любые неправильные события интеграции вручную. Флуоресцентные сигналы, наблюдаемые между 4,13 и 4,67 минутами, исходили от нереакционной APTS. Алеутское время меченой мальтогексаозы DP 6 оценивалось в 8,49 минуты.

Маркированные APTS глюканы бычьего гликогена были идентифицированы на основе алеутского времени DP 6. Никаких следов свободного мальтоолигосахарида не было обнаружено в контрольном образце, в котором гликоген не инкубировали с деветривающими ферментами. На врезной панели показано разделение цепей Glucan до 44 DP. Распределение длины цепи отображается в процентах DP для каждого DP. Среднюю длину цепи рассчитывали путем суммирования каждого процента времени цепи на соответствующую степень полимеризации.

Анализ лица показал, что наиболее распространенными глюканами являются мальтоза и печень кролика, мальтогексаоза в устрице и мальтогептаоза в бычьей печени. Распределение по длине цепи гликогена, очищенного от диких типов и мутантных бактериальных штаммов цианобактерий, определяли с помощью анализа лица. Субтрактивный анализ проводился путем вычитания процента каждого DP дикого типа из процента каждого DP мутантов.

Распределение гликогена дикого типа и мутантов Synechocystis по длине цепи было нормализовано в соответствии с максимальным пиком, наблюдаемым для каждой CLD. Этот метод позволяет лучше понять заболевания человека, связанные с дефектом метаболизма гликогена, в частности болезнь Андерсена, богатые результаты накопления аномальных частиц гликогена в клетках.