Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду

Здесь описаны протоколы для подготовки вирусных сборок, пригодных для жидкостно-ЭМ и крио-ЭМ анализа на наноуровне с использованием просвечивающей электронной микроскопии.

Интерес к жидкостной электронной микроскопии резко возрос в последние годы, поскольку теперь мы можем визуализировать на наноуровне процессы реального времени. Улучшенные знания об этих гибких структурах могут помочь нам в разработке новых реагентов для борьбы с новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Просмотр белков в жидкой среде помогает имитировать биологические системы и дает нам возможность взглянуть на белки более динамичным образом.

И этот эксперимент покажет вам новые методы использования и визуализации белков как в стекловидном льду, так и в жидкой среде. Последние результаты включают динамическое понимание вакцин-кандидатов в терапии на основе антител, изображенной в жидкости. Коррелятивные жидкостные и крио-ЭМ-приложения повышают нашу способность визуализировать молекулярную динамику, обеспечивая уникальный контекст для здоровья и болезней человека.

Читатели, использующие обычные технологии ТЭМ или крио-ЭМ, могут рассмотреть возможность внедрения рабочих процессов жидких ЭМ для обеспечения новых динамических наблюдений за своими образцами таким образом, чтобы дополнить их текущие стратегии. Коммерчески доступные жидкостно-электромагнитные системы могут обеспечивать поток, смешивание, электрохимические стимулы и контроль температуры, которые необходимы для многих приложений визуализации в режиме реального времени. Представленный здесь метод сэндвича с микрочипами описывает простой способ начального уровня для первого просмотра образцов в жидкости, прежде чем перейти к более сложной коммерческой системе для экспериментов in situ.

Для начала очистите микрочипы нитрида кремния, инкубируя каждый чип в 150 миллилитрах ацетона в течение двух минут, с последующей инкубацией в 150 миллилитрах метанола в течение двух минут. Дайте стружке высохнуть в ламинарном воздушном потоке. Плазменная очистка высушенной стружки с помощью прибора тлеющего разряда, работающего в стандартных условиях в течение 45 секунд с использованием газа аргона.

Затем загрузите микрочип сухим основанием в наконечник держателя образца и добавьте около 0,2 микролитра образца в базовый чип. После инкубации в течение одной-двух минут поместите верхний чип на влажную основу, содержащую образец. Сажьте сборку вместе, чтобы сформировать герметично закрытый корпус, механически удерживаемый на месте тремя латунными винтами.

Накачайте наконечник до 10 до минус шести торр с помощью турбонасосной сухой насосной станции. Теперь держатель готов к установке в ТЕА. Плазменная очистка микрочипов и углеродных решеток с помощью прибора тлеющего разряда в течение 45 секунд.

И добавьте около двух микролитров образца к микрочипу с разряженным свечением, помещенному на гелевую упаковку. Удалите лишний раствор с помощью фильтровальной бумаги или пипетки и высиживайте в течение одной-двух минут. Затем добавьте тлеющую разряженную углеродную сетку к мокрому микрочипу, содержащему образец.

Посадите сборку вместе, используя один держатель для наклонных образцов при комнатной температуре, чтобы сформировать герметично закрытый корпус. Кроме того, можно использовать зажимы сетки автозагрузчика и поместить сэндвич-узел на нижний зажим C. Поместите верхний зажим поверх сборки и используйте стандартный зажимной инструмент, чтобы запечатать узел вместе.

В настоящее время образец готов к включению в ТЕА. Исследуйте образцы, помещенные в автозагрузчики в криоаналиматах или при комнатной температуре. Для получения жидкостно-электромагнитной визуализации загрузите держатель образца в ТЕА, оснащенный полевой эмиссионной пушкой, и работайте при 200 киловольтах.

Включите пистолет и отрегулируйте эйцентрическую высоту ступени микроскопа по отношению к образцу с помощью функции воблера, наклонив образец от минус 15 градусов до плюс 15 градусов в колонне. Эта процедура регулирует ступень в направлении Z, чтобы приспособиться к толщине образца и помогает обеспечить точное увеличение во время записи изображения. Записывайте изображения в виде длинных кадров или отдельных изображений с помощью программного пакета для сбора последовательных данных, реализуя автоматизированные процедуры обработки изображений.

Получайте изображения в условиях низких доз с увеличением от 28 000X до 92 000X и 40 кадров в секунду. Отрегулируйте время экспозиции, чтобы свести к минимуму повреждение луча образцом, и используйте диапазон расфокусировки от минус одного до четырех микрометров при указанном увеличении. При обнаружении толстого раствора используйте более высокие значения расфокусировки или выберите другую интересующую область.

Убедитесь, что раствор присутствует в образцах на протяжении всего сеанса визуализации, фокусируя электронный пучок на жертвенной области, не используемой для сбора данных, пока не образуются пузырьки. Анализируйте фильмы на наличие частиц SARS-CoV-2 с помощью программы RELION-3.0.8 или любого другого программного обеспечения для обработки изображений. Выполните коррекцию движения с помощью программы MotionCor2.

После исправления извлекайте частицы с помощью инструмента автоподбора в программном пакете. Типичные размеры коробки составляют 330 пикселей для жидких образцов и 350 пикселей для образцов льда. Рассчитайте начальные реконструкции, используя симметрию C1 с помощью процедуры начальной 3D-модели программы и параметров модели ab initio в программном пакете для обработки данных.

Затем выполните уточнение протоколов в программном обеспечении для обработки данных. Изучите результаты с помощью программного пакета для анализа молекулярной структуры при оценке динамических изменений. Здесь показано сравнение жидких ЭМ и крио-ЭМ структур в аденоассоциированном вирусе третьего подтипа или AAV.

Репрезентативные изображения показывают структуру AAV в растворе и во льду. Здесь показаны вращательные виды субъединицы AAV VP1, извлеченной из жидких и ледяных структур. Эти изображения представляют динамические значения в жидких структурах, генерируемых с помощью функции морфной карты в программном обеспечении для анализа молекулярной структуры.

Средние структуры из нескольких вирусных сборок показывают конформационные изменения с почти 5% изменением диаметра, измеренным с использованием электромагнитных данных. Здесь показано изображение субвирусных сборок SARS-CoV-2, выделенных из сывороточных фракций пациентов с COVID-19. Эти белые пузырьки указывают на наличие жидкости в образце.

Эм-реконструкция этих субвирусных сборок показана здесь с цветными радиальными плотностями на пяти нанометровых срезах через карту. Репрезентативное изображение описывает анализ ротавирусных двухслойных частиц, приготовленных в стекловидном льду с использованием метода сэндвича с микрочипом. Использование моющих средств, глицерина, полиэтилена, гликолей и высоких уровней сахара следует свести к минимуму или избегать для визуализации жидкостной ЭМ.

Эти реагенты могут вводить артефакты, создавать чрезмерное пузырьки, продукты гидролиза и свободные радикалы из-за повреждения пучка. Использование этих протоколов позволит ученым иметь возможность изучать динамические процессы в атомных деталях. И это охватывает несколько областей науки, включая медицину, науки о жизни и исследования материалов.

Представленные здесь протоколы описывают, как современные инструменты могут обеспечить захватывающие средства для визуализации биологических макромолекул новыми глазами. Область жидкостной электронной микроскопии может повысить то, как мы изучаем эти новые вирусы, которые представляют угрозу для здоровья человека, возможно, даже способствуя нашим мерам по обеспечению готовности к пандемии.