Определение молекулярной структуры гликопротеинов ВИЧ Конверт использованием крио-электронной томографии и автоматизированных Sub-томограмма усреднения

Более 60 миллионов человек были инфицированы ВИЧ – вирусом, вызывающим СПИД. ВИЧ/СПИД – это глобальный кризис в области здравоохранения, и хотя интенсивные исследования значительно улучшили жизнь инфицированных людей, настоящая вакцина остается недостижимой. Основное внимание в исследованиях вакцины против ВИЧ уделяется гликопротеину оболочки, который ВИЧ использует для проникновения в клетки-мишени.

В этом видео мы демонстрируем, как мы получаем структуры этого важного белка с помощью метода визуализации, называемого криоэлектронной томографией. Начиная с очищенного ВИЧ, мы показываем этапы подготовки замороженных образцов, этапы записи электронно-микроскопических изображений этих замороженных образцов и этапы преобразования этих изображений в структурные модели, которые могут быть полезны для разработки вакцины против ВИЧ/СПИДа. Уникальным аспектом того, что мы представляем в этом видео, является то, что работа будет продемонстрирована членами ее лаборатории, охватывающими широкий диапазон возрастов, от учащихся средних и старших классов до студентов колледжей и аспирантов, а также постдокторантов и старших ученых.

Подготовка витрифицированных образцов вирусов, пригодных для криоэлектронной томографии, осуществляется путем распыления водной суспензии вирусов через небольшие отверстия в углеродной пленке, поддерживаемой медной сеткой, а затем быстрого замораживания вирусов. Цель этого шага — подготовить замороженный образец интактных вирусов, захваченных в состоянии, близком к нативному. Для начала решетки помещаются внутрь блока разряда накаливания.

Это устройство очищает решетки, подвергая их воздействию ионизированного газа. Теперь, когда сетки готовы к использованию, готовится суспензия вирусов, смешанная с мелкими частицами золота. Эти частицы необходимы для сбора и обработки данных.

Далее капля вирусной суспензии помещается на только что очищенную плазму сетку. Затем сетка загружается в робота, который промакивает ее фильтровальной бумагой, уменьшая каплю до тонкой пленки жидкости. Затем образец погружают в жидкий этан, который быстро замораживает вирусы со скоростью, превышающей 100 000 кельвинов в секунду.

Затем погружная замороженная сетка перемещается в ящик для хранения для транспортировки в микроскоп. Это повторяется до тех пор, пока нужное количество сеток не будет заморожено. Теперь, когда сетки для образцов вируса готовы, следующим шагом будет их загрузка в микроскоп.

Для визуализации это можно сделать вручную или с помощью робота. Когда сетки для образцов загружаются вручную, пользователь сидит на специализированной станции, где с образцами можно манипулировать под жидким азотом, образцы помещаются в портативную камеру с азотным охлаждением, которая герметизируется, вакуумируется, а затем подключается к микроскопу. Новые микроскопы способны более автоматизированно загружать образцы.

Здесь, в микроскопе Titan Cryos, замороженные образцы доставляются в микроскоп пользователем, а затем загружаются роботизированными сетками для образцов, загруженными в микроскоп. Каждая сетка может быть изучена пользователем до начала визуализации. Параметры микроскопа задаются для каждой области сетки образца, которая имеет интересующие особенности.

В данном случае признаками являются вирусы ВИЧ. По мере определения каждой новой области компьютер микроскопа сохраняет параметры изображения, специфичные для этой области. Когда пользователь определил все интересующие его позиции, компьютер автоматически возвращается к каждой позиции и собирает набор данных.

Каждый набор данных собирается путем наклона сетки образцов по отношению к электронному пучку, при этом следя за тем, чтобы луч оставался сфокусированным в одном и том же месте на сетке. Сбор данных в электронной микроскопии традиционно требовал от пользователей сидеть за микроскопом и физически взаимодействовать с оборудованием. Этот стиль взаимодействия с микроскопом показан здесь во время визита президента Обамы на завод по производству разведданных.

Последние достижения в области компьютерных интерфейсов микроскопов теперь позволяют пользователям контролировать и корректировать сбор данных в режиме реального времени с удаленного компьютера в лаборатории или где-либо еще. Для того, чтобы визуализировать форму оболочки, всплески гликопротеина, информация от сотен отдельных изображений должна быть усреднена для усиления сигнала. Это процесс, требующий больших вычислительных ресурсов, который здесь осуществляется с помощью кластера компьютеров под названием Bio Wolf.

В NIH были разработаны мощные методы извлечения отдельных объемов и усреднения информации с использованием алгоритмов, которые могут работать при высоких уровнях шума. Присущие этому типу данных карты плотности, полученные как от нативных вирусов, так и от комплекса вирусов до биологически важных молекул, обеспечивают богатую базу данных информации о структурной биологии ВИЧ. Карты плотности оживают при молекулярной детализации, когда данные объединяются с информацией рентгеновской кристаллографии отдельных субъединиц, составляющих оболочку гликопротеинового шипа.

Данные, получаемые из этого томоса, могут быть очень плотными и сложными для interpret. 3D программное обеспечение для индустрии развлечений может быть использовано для визуализации 3D-моделей, добавляя цвета, текстуры и освещение, что облегчает их анализ. Обычно используемое программное обеспечение для визуализации включает в себя Mirror 3D Studio Max и Maya.

Мы только что продемонстрировали пошаговые процедуры получения молекулярных моделей структуры оболочки. Гликопротеин, начиная с очищенного ВИЧ. Используя этот метод, мы также определили структуры гликопротеина оболочки в комплексе с различными молекулами, которые могут связывать и использовать вирус.

Здесь мы показываем пример структуры гликопротеина оболочки в комплексе с антителом под названием B12. Понимание того, почему одни молекулы могут связывать вирус и использовать его, а другие нет, очень важно для рационального дизайна вакцины. Определение молекулярных структур оболочечных гликопротеинов ВИЧ или других вирусов, таких как грипп и лихорадка Эбола, является ключом к пониманию проникновения вируса и его использования.

Как вы уже видели, криоэлектронная томография в настоящее время становится мощным инструментом для достижения этой цели.