Структура ВИЧ-1 капсида Ассамблеи по крио-электронной микроскопии и итерационных Винтовая реальном пространстве реконструкции

Общая цель данной процедуры заключается в том, чтобы предложить метод получения трехмерной структуры собранных молекул с помощью криоэлектронной микроскопии. Протокол начинается с подготовки крио-ЭМ-образцов с использованием метода быстрого разбавления и обратной стороны блоттинга для временного снижения концентрации соли при приготовлении замороженной гидратированной ЭМ-сетки. Этот процесс обеспечивает стабильность белка при одновременном снижении фонового шума и улучшении соотношения сигнал/шум во время сбора данных о низкой дозе крио-ЭМ, который следует за сбором данных.

Завершена спиральная индексация дифракционных картин. Затем выполняется обработка изображения, за которой следует 3D-реконструкция в реальном пространстве, в результате чего создается окончательная карта плотности одного капсида или трубки CA. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что есть несколько критических точек для оптимального сбора и анализа данных.

Например, в случае ВИЧ один капсид трубчатых сборок, которые образуются только в одном молярном исходном растворе, быстро снижая концентрацию соли без влияния на структуру. Очень важно получать высококачественные крио-ЭМ изображения. Имея изображение трубки, очень трудно понять, что делать для индексации критической трубки и какое программное обеспечение можно рассматривать для 3D-реконструкции.

В этом видео представлен подробный и простой подход к получению 3D-реконструкции физических объектов, который может быть использован в качестве основы для вашего эксперимента. Я буду демонстрировать процедуру с доктором Пуджей. Мы оба постдоки из Dr.Laboratory Чтобы подготовить сборки белка одного капсида ВИЧ для криоэма, начните со свечения, разряжая углеродную сторону медных сеток 200 меш под давлением 25 миллиампер в течение 25 секунд.

С помощью небулайзера доведите влажность до 80% в климатической камере, которая представляет собой самодельный ручной гравитационный поршень. Тем временем, охлаждая жидкий этан в пробирке с помощью плунжера с жидким азотом, установите плунжерного дозатора на ручной гравитационный плунжер. Далее с помощью щипцов зажмите клещи, закрытые на краю сетки.

Нанесите 2,5 микролитра предварительно собранного белкового раствора на угольную сторону сетки. Затем загрузите щипцы на поршень угольной стороной решетки стороной наружу. Добавьте три микролитра буфера с низким содержанием соли на обратную сторону сетки.

Сразу же промокните сетку листом фильтровальной бумаги с той же стороны. Держите всю заднюю поверхность сетки в плотном контакте с фильтровальной бумагой в течение примерно шести секунд. Сняв фильтровальную бумагу, сразу же погрузите сетку в жидкий этан.

Наконец, извлеките щипцы из поршня и быстро перенесите сетку в ящик для хранения сетки. Начните криоэлектронную микроскопию с загрузки замороженной гидратированной сетки в полярный двухэлектронный микроскоп FEI G. Работает от напряжения 200 киловольт и оснащен CCD-камерой Gatin 4K by 4K.

В режиме поиска низкой дозы добавьте увеличение примерно в 200 раз. Экранируйте всю сетку на предмет областей с подходящим льдом. Сохраните положения этих областей в файле этапа.

Вспомните сохраненные позиции и дополнительно просейте эти области. Добавьте увеличение 3, 900 раз в режиме поиска низкой дозы. Для сбора данных выберите участки с равномерным тонким слоем льда, которые характеризуются наличием длинных трубок, подвешенных над отверстием.

Сохраните все области в файле второго этапа. Переключитесь в режим экспозиции. Добавьте увеличение 59 000x и вставьте апертуру объектива 100 микрометров.

Затем отрегулируйте объективный стигматизм и интенсивность пучка для дозы примерно 15 электронов на ангстрем в квадрате за одно воздействие. Вернитесь в режим поиска низкой дозы и переместитесь в сохраненное положение. Определите и отцентрируйте хорошую трубку.

С помощью ПЗС-камеры переключитесь в режим фокусировки, отрегулируйте фокусировку и установите нормальное значение расфокусировки в диапазоне от 0,5 до 2,5 микрометров. Затем переключитесь в режим воздействия и установите время воздействия от 0,3 до 0,5 секунды для дозы 15 электронов на ангстрем в квадрате. Соберите изображения на пластинчатую камеру, дав пленке отстояться в течение 10 секунд перед экспозицией.

После сбора изображений перейдите к следующей сохраненной позиции и повторите этот процесс, чтобы собрать больше изображений. Проявите пленки в полную силу D 19 в течение 12 минут. Затем оцифруйте изображения с помощью сканера Nikon Super cool scan 9,000 ED с размером пикселя 6,35 микрометра.

Винтовой объект может быть проиндексирован по двум параметрам. Порядок Бесселя N и номер линии слоя L в преобразовании форера решетки поверхности спирального объекта. Каждая линия слоя характеризуется N и L и соответствует набору линий на поверхностной решетке, обозначаемых индексами H и K.

Чтобы начать винтовую индексацию, с помощью программы Iman Helix boxer упаковывают относительно длинную и прямую трубку одинакового диаметра и сохраняют изображение в формате MRC. Затем измерьте радиус трубки с помощью программы Имана Boxer. Определите расстояние повтора HEL с помощью программы, основанной на взаимной корреляции, такой как I-M-G-C-C-F в пакете MRC.

Затем рассчитайте фойе. Преобразуйте с помощью новой длины прямоугольника, которая является интегралом от расстояния повтора. Затем выберите две основные линии слоя, которые определяют два основных вектора поверхностной решетки: один ноль и ноль, единицу в единицах пикселя БПФ.

Определите номера линий слоя, а также радиусы максимальной амплитуды для двух основных линий слоя в преобразовании Фурье. Учитывая номера линий слоя и значения порядков Бесселя для двух основных линий слоя, вращение между субъединицами и осевый подъем спирали одной звезды могут быть получены с помощью правила выбора, как описано в письменной процедуре. Эти два вещественных числа описывают винтовую симметрию трубки.

3D-реконструкция начинается с сегментации частиц с помощью программы Iman. Боксёр. Открыв микрофотографию, содержащую спиральные частицы, разрежьте частицу на перекрывающиеся сегменты на панели управления боксера. Выберите режим спирали и задайте параметры для бокса.

Размер коробки должен быть больше диаметра частицы, а значение OLA должно составлять около 90% от размера коробки. После того, как вы налево, щелчок по любому из концов боксера частиц автоматически сгенерирует серию коробок частиц по длине спирали, сохранит упакованные сегменты, а также их координаты. Следующим шагом является выполнение первичной 3D-реконструкции с использованием итерационного метода реконструкции спирального реального пространства I-H-R-S-R перед обработкой с помощью I-H-R-S-R.

Инвертируйте контрастность крио-ЭМ изображений и примените фильтрацию LOWPASS. Затем откройте графический интерфейс программы I-H-R-S-R, набрав генератор текста. Предоставьте графическому интерфейсу всю информацию о стеке упакованных частиц, включая имя и путь к стеку, количество изображений в стеке и значения параметров симметрии.

Нажмите кнопку «Готово», чтобы создать сценарий реконструкции. B 25 SP. Я использую твердый или полый цилиндр в качестве исходного образца и позволяю процедуре повторяться до тех пор, пока не произойдет изменений в определенной симметрии винта, что обычно происходит после нескольких циклов. Симметрия правой спирали должна давать стабильно сходящуюся реконструкцию.

Реконструкция, полученная в прошлом цикле, будет использоваться в качестве исходного эталона для дальнейшей доработки. Наконец, выполните 3D-реконструкцию с итеративным уточнением, используя 3D-карту плотности, созданную I-H-R-S-R, в качестве исходного образца для дополнительной доработки во время уточнения. Спиральная симметрия фиксируется при вращении между субъединицами и осевом подъеме, которые определяются с помощью процедуры I-H-R-S-R.

Затем определите расфокусировку и астигматизм, присутствующие на микрофотографии, с помощью программ CTF find three и CTF tilt с помощью программ-пауков, называемых FT и mu умножающими сегменты частиц на функцию переноса контраста. Сокращенно CTF выполняют сопоставление проекций путем сравнения проекций эталонных объемов с скорректированными изображениями CTF с использованием множественного эталонного выравнивания. Изменение угла наклона за пределами плоскости ограничено плюсом или минус 10 градусами, а выборка с шагом в один градус вводит ограничения, такие как высокие коэффициенты корреляции при плоских углах около нуля градусов или 180 градусов и ограниченные сдвиги по X.

Для выравнивания параметров каждого сегмента включаются в реконструкцию только те сегменты, которые удовлетворяют ограничениям. После каждого итерационного цикла уточнения 3D-реконструкция создается с использованием обратной проекции и делится на некоторое количество в квадрате CTF, накладывая спиральную симметрию для создания объема симметрии. Итерационное уточнение прекращается, когда дальнейшее улучшение разрешения новой 3D-реконструкции не происходит.

Одна сборка с одним капсидом HIV, трубка 92 e, была упакована, и ее преобразование Фурье рассчитано для спиральной индексации двух радиусов, определены номера линий слоя и радиусы максимальной амплитуды для линий слоя один, ноль и ноль один. Затем были рассчитаны конечные значения отрицательных 12 и 11 для одного нуля и нуля соответственно с расстоянием повторения 5195,48 ангстрем. Винтовая симметрия трубки была определена как дельта Z равна 6,81 ангстремам, а дельта пять равна 328,88 градусам, дельта Z и дельта пять была уточнена до 7,13 ангстрем и 328,86 градусов с использованием I-H-R-S-R, и первоначальная реконструкция была получена после 10 итерационных циклов.

Окончательная реконструкция после итерационного уточнения значительно улучшила карту плотности по сравнению с исходной моделью, рассчитанной с помощью I-H-R-S-R. Карта плотности труб капсидной сборки отображается в виде трех ортогональных срезов, параллельных оси трубки и близко к поверхности, перпендикулярных оси трубы и параллельных и проходящих через ось трубы. Отображаемая структура является результатом рендеринга поверхности 3D-карты плотности с контуром 1,8 Сигма и 100% объема.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться очень хорошее понимание того, как получить 3D-структуру собранной молекулы с помощью электронной микроскопии.