Структура ВИЧ-1 капсида Ассамблеи по крио-электронной микроскопии и итерационных Винтовая реальном пространстве реконструкции

Общая цель данной процедуры — предоставить метод получения трехмерной структуры собранных спиралевидных молекул с помощью криоэлектронной микроскопии. Протокол начинается с подготовки образца для крио-ЭМ с использованием метода быстрого разбавления и протирания с обратной стороны для кратковременного снижения концентрации соли при подготовке замороженной гидратированной сетки для ЭМ. Этот процесс обеспечивает стабильность белка, одновременно снижая уровень фонового шума и улучшая соотношение сигнал/шум во время последующего сбора данных при низком облучении в крио-ЭМ.

Спиральная индексация дифракционных картин завершена. Затем выполняется обработка изображений с последующей 3D-реконструкцией в реальном пространстве, в результате чего получается итоговая карта плотности одного капсида HIV или трубки ca. Как правило, пользователи, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как существует несколько критических моментов для оптимизации сбора и анализа данных.

Например, в случае с ВИЧ трубчатые сборки одного капсида образуются только в одном молярном исходном растворе при быстром снижении концентрации соли без изменения структуры. Крайне важно получить высококачественные изображения с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). При наличии изображения трубки бывает очень сложно определить, как индексировать критическую трубку и какое программное обеспечение следует использовать для 3D-реконструкции.

В данном видео представлен детальный и простой подход к получению 3D-реконструкции физических объектов, который может быть использован в качестве руководства для вашего эксперимента. Я продемонстрирую процедуру вместе с д-ром Пуджей. Мы оба являемся постдоками из лаборатории д-ра [Laboratory]. Для подготовки сборок капсидного белка HIV-1 для крио-электронной микроскопии начните со свечения (glow discharge) углеродной стороны медных сеток с размером ячеек 200 mesh при токе 25 мА в течение 25 секунд.

Используйте небулайзер, чтобы довести влажность в климатической камере, представляющей собой самодельный ручной гравитационный планжер, до 80%. Тем временем охладите жидкий этан в специальном держателе для планжера с помощью жидкого азота и установите устройство для шоковой заморозки на ручной гравитационный планжер. Затем с помощью пинцета зажмите край сетки.

Нанесите 2,5 µl предварительно собранного белкового раствора на углеродную сторону сетки. Затем поместите пинцет с сеткой на поршень так, чтобы углеродная сторона была обращена от него. Добавьте 3 µl буфера для разведения с низким содержанием соли на обратную сторону сетки.

Сразу же промокните сетку кусочком фильтровальной бумаги с той же стороны. Плотно прижимайте всю обратную поверхность сетки к фильтровальной бумаге в течение примерно шести секунд. После удаления фильтровальной бумаги немедленно погрузите сетку в жидкий этан.

Наконец, извлеките пинцет из поршня и быстро перенесите сетку в бокс для хранения сеток. Приступите к криоэлектронной микроскопии, поместив замороженную гидратированную сетку в электронный микроскоп FEI polar G two. Работа микроскопа осуществляется при напряжении 200 kilovolts; прибор оснащен CCD-камерой Gatan 4K by 4K.

В режиме поиска при низкой дозе установите увеличение примерно 200 x. Просканируйте всю сетку для поиска участков с подходящим льдом. Сохраните координаты этих участков в файле столика.

Вернитесь к сохраненным позициям и проведите дополнительный скрининг этих областей. Установите увеличение 3 900 x в режиме поиска с низкой дозой облучения. Для сбора данных выберите области с однородным тонким слоем льда, которые характеризуются наличием длинных трубок, подвешенных над отверстием.

Сохраните все области в файл второго этапа. Перейдите в режим экспозиции. Установите увеличение 59 000 x и вставьте апертурную диафрагму объектива 100 мкм.

Затем отрегулируйте стигматизм объектива и интенсивность пучка, чтобы доза составила примерно 15 электронов на квадратный ангстрем за одно облучение. Вернитесь в режим поиска с низкой дозой и переместитесь к сохраненной позиции. Найдите и центрируйте подходящую трубку.

Используя ПЗС-камеру, переключитесь в режим фокусировки, отрегулируйте фокус и установите значение дефокусировки, обычно в диапазоне от 0.5 до 2.5 micrometers. Затем перейдите в режим экспозиции и установите время экспозиции от 0.3 до 0.5 seconds для дозы 15 electrons per angstrom squared. Соберите изображения на пластинчатой камере, дав пленкам стабилизироваться в течение 10 seconds перед началом экспозиции.

После получения изображений перейдите к следующей сохраненной позиции и повторите этот процесс для получения дополнительных снимков. Проявите пленки в полноконцентрированном растворе D 19 в течение 12 минут. Затем оцифруйте изображения с помощью сканера Nikon Super cool scan 9, 000 ED с размером пикселя 6.35 micrometers.

Спиральный объект может быть индексирован двумя параметрами: порядком функции Бесселя N и номером линии слоя L в преобразовании Фурье поверхностной решетки спирального объекта. Каждая линия слоя характеризуется значениями N и L и соответствует набору линий на поверхностной решетке, обозначаемых индексами H и K.

Для начала спирального индексирования используйте программу Helix boxer из пакета Iman, чтобы выделить относительно длинный и прямой участок трубки с равномерным диаметром, и сохраните изображение в формате MRC. Затем измерьте радиус трубки с помощью программы boxer из пакета Iman. Определите период спирали (HEL), используя программу на основе кросс-корреляции, такую как I-M-G-C-C-F из пакета MRC.

Затем рассчитайте фойе. Выполните преобразование с новой длиной бокса, которая является кратной расстоянию повтора. Далее выберите две основные линии слоев, определяющие два базовых вектора решетки поверхности — один ноль и ноль один в единицах пикселя FFT.

Определите номера слоевых линий, а также радиусы максимальной амплитуды для двух основных слоевых линий в преобразовании Фурье. Зная номера слоевых линий и значения порядков функций Бесселя для двух основных слоевых линий, можно рассчитать угол поворота между субъединицами и осевой шаг одной звездной спирали, используя правило отбора, описанное в письменной процедуре. Эти два действительных числа описывают винтовую симметрию трубки.

3D-реконструкция начинается с сегментации частиц с помощью программы Iman.Boxer. После открытия микрофотографии, содержащей спиралевидные частицы, разбейте частицу на перекрывающиеся сегменты в панели управления Boxer. Выберите режим helix и установите параметры боксирования.

Размер бокса должен быть больше диаметра частицы, а значение OLA должно составлять около 90% от размера бокса. После этого нажатие на любой конец бокса частицы автоматически создаст серию боксов частиц вдоль длины спирали, а также сохранит выделенные сегменты и их координаты. Следующим шагом является выполнение первичной 3D-реконструкции с использованием метода итеративной реконструкции спиралей в реальном пространстве I-H-R-S-R перед последующей обработкой с помощью I-H-R-S-R.

Инвертируйте контраст изображений крио-ЭМ и примените фильтрацию LOWPASS. Затем откройте графический интерфейс программы I-H-R-S-R, введя команду generator. Введите в графическом интерфейсе всю информацию о стеке выделенных частиц, включая имя и путь к стеку, количество изображений в стеке и значения параметров симметрии.

Нажмите кнопку finish, чтобы создать скрипт реконструкции. B 25 SP.I используйте сплошной или полый цилиндр в качестве начального эталона и повторяйте процедуру до тех пор, пока в определенной винтовой симметрии не прекратятся изменения, что обычно происходит после нескольких циклов. Правая спиральная симметрия должна обеспечить стабильно конвергирующую реконструкцию.

Реконструкция, полученная на предыдущем цикле, будет использована в качестве исходного референса для дальнейшего уточнения. В завершение выполните 3D-реконструкцию с итерационным уточнением, используя 3D-карту плотности, созданную с помощью I-H-R-S-R, в качестве исходного референса для дополнительного уточнения в процессе рефаймента. Спиральная симметрия фиксируется по углу поворота между субъединицами и осевому подъему, значения которых определяются в ходе процедуры I-H-R-S-R.

Затем с помощью программ CTF find и CTF tilt в составе пакета spider определите величину дефокусировки и астигматизма на микрофотографии; затем с использованием функции FT и mu перемножьте сегменты частиц на функцию передачи контраста (CTF). Выполните сопоставление проекций, сравнивая проекции референсных объемов с изображениями, скорректированными по CTF, с помощью многореференсного выравнивания (multi reference alignment). Вариация угла наклона вне плоскости ограничена диапазоном ±10° с шагом в 1°, при этом вводятся такие ограничения, как высокие коэффициенты корреляции при углах в плоскости, близких к 0° или 180°, и ограниченные сдвиги по оси X.

При определении параметров выравнивания для каждого сегмента в реконструкцию включайте только те сегменты, которые удовлетворяют заданным ограничениям. После каждого цикла итеративного уточнения создается 3D-реконструкция методом обратной проекции с делением на квадрат функции передачи контраста (CTF), после чего накладывается винтовая симметрия для получения усредненного по симметрии объема. Итеративное уточнение прекращается, когда дальнейшего улучшения разрешения новой 3D-реконструкции не наблюдается.

Для одной сборки капсида ВИЧ-1, представляющей собой трубку с 92 единицами, было выполнено выделение области (boxing out) и рассчитано преобразование Фурье для индексации спирали по двум радиусам; были определены номера слойных линий и радиусы максимальной амплитуды для слойных линий 10 и 01. Затем для 10 и 01 были рассчитаны значения -12 и 11 соответственно при периоде повторения 5195,48 angstroms. Винтовая симметрия трубки была определена как delta Z = 6,81 angstroms и delta phi = 328,88 degrees; значения delta Z и delta phi были уточнены до 7,13 angstroms и 328,86 degrees с помощью I-H-R-S-R, после чего по завершении 10 итерационных циклов была создана первичная реконструкция.

Финальная реконструкция после итеративного уточнения значительно улучшила карту плотности по сравнению с начальной моделью, рассчитанной с помощью I-H-R-S-R. Карта плотности трубок сборки капсида представлена в виде трех ортогональных срезов: параллельно оси трубки и близко к ее поверхности, перпендикулярно оси трубки, а также параллельно и через ось трубки. Отображаемая структура получена путем отрисовки поверхности 3D-карты плотности с контурированием при 1.8 Sigma, охватывающим 100% объема.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как получить 3D-структуру полностью собранной молекулы с помощью криоэлектронной микроскопии.