Растворимый редукционный анализ на основе тетразолия для оценки влияния антител на биопленки Candida tropicalis

В настоящем документе описан протокол на основе пластин на основе 96-луночных микротитров с использованием редукционного анализа 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилида-2H-тетразолия (XTT) для изучения влияния антител на биопленки, образованные C. tropicalis. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.

Этот протокол in vitro на основе 96 пластин может быть использован для проверки ингибирующего действия антител на новые противогрибковые агенты на метаболическую активность грибковых клеток в биопленках Candida. По сравнению с другими методами, это высокочувствительный, точный, высокопроизводительный, воспроизводимый, удобный для пользователя и экономически эффективный метод оценки влияния антител или противогрибковых препаратов на развитие биопленок Candida. Этот анализ может быть использован для оценки эффективности новых лекарственных средств или антител, а также вакцин-кандидатов против биопленок Candida, которые связаны с тяжестью инвазивного кандидоза.

Этот метод может быть применен для тестирования эффекта новых противогрибковых агентов или антител во время образования или созревания биопленки в различных условиях с использованием различных грибковых штаммов или источников антител. Продемонстрировать эту процедуру будет г-н Панкадж Чандли, доктор философии, работающий в моей лаборатории. Для начала добавьте 100 микролитров культуры Candida tropicalis в 96-луночную микротитровую пластину.

Используя многоканальную пипетку, заполните последние две колонки 100 микролитрами только среды RPMI 1640 MOPS. Накройте микротитровую пластину крышкой и алюминиевой фольгой и инкубируйте пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в стационарных условиях. На следующий день тщательно аспирируйте среду с помощью многоканальной пипетки.

Аккуратно переверните пластину на листах для промокания и постучите, чтобы удалить остаточную среду. Вымойте пластину 200 микролитрами 1X PBS с помощью многоканальной пипетки. Тщательно аспирируйте PBS с помощью многоканальной пипетки и дважды мойте PBS.

Чтобы удалить избыток PBS, высушите пластину на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре внутри шкафа биологической безопасности. Подготовка серийных разведений термоинактивированных образцов сыворотки в стерильной среде RPMI 1640 MOPS. Добавьте 100 микролитров выбранного разведения сыворотки в каждую лунку 96-луночной микротитровой пластины.

В колонке 10 добавьте только среду RPMI 1640 MOPS для положительного контроля только гриба. Добавьте от одного до 50 разведений сыворотки во все колодцы в колонке 11, чтобы служить в качестве отрицательного контроля без грибка плюс сыворотка. После покрытия пластины крышкой и алюминиевой фольгой, инкубируйте пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия.

На следующий день, после тщательного аспирации сыворотки с помощью многоканальной пипетки, осторожно постучите по перевернутой пластине, чтобы удалить остаточную сыворотку. Повторите промывку PBS три раза и высушите пластину на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре внутри шкафа биологической безопасности, чтобы высушить любые излишки PBS. Затем растворите 25 миллиграммов XTT в 50 миллилитрах стерилизованного фильтром лактата Рингера.

Аликвот 10 миллилитров в отдельных тубах. Накройте его алюминиевой фольгой и храните при минус 80 градусах Цельсия. Далее растворяют 8,6 миллиграмма менадиона в пяти миллилитрах ацетона.

А после распределения 50 микролитров в 100 отдельных микротрубках храните аликвоты при минус 80 градусах Цельсия. Возьмите 10 миллилитров XTT и добавьте один микролитр менадиона, чтобы получить один микромолярный рабочий раствор. Добавьте 100 микролитров раствора менадиона XTT на лунку 96-луночной микротитровой пластины.

Далее, после покрытия пластины крышкой и алюминиевой фольгой, высиживают пластину в течение двух часов при 37 градусах Цельсия в темноте. Наконец, перенесите 80 микролитров цветного супернатанта из каждой скважины в свежую 96-луночную пластину и считайте пластину на 490 нанометров. Сыворотка от мышей, иммунизированных Sap2-парапсилезом, может предотвратить созревание предварительно сформированных биопленок Candida tropicalis на 65% по сравнению с 45% в сыворотке от Sap2-альбиканов и на 55% у мышей, иммунизированных Sap2-tropicalis.

В целом, ингибирование биопленки иммунной сывороткой Sap2 было значительно выше, чем в фиктивной иммунной сыворотке, что составляет 16% и 13% в преиммунной сыворотке. Ингибирование биопленки было близко к незначительному при использовании PBS и отсутствии сывороточного контроля. При выполнении этапов промывки следует проявлять максимальную осторожность, чтобы предотвратить разрушение биопленок.

Раствор XTT должен быть приготовлен непосредственно перед использованием и немедленно добавлен в тарелку. Следуя этой процедуре, пользователи могут оценить эффект новых противогрибковых агентов, вакцин-кандидатов или антител во время формирования и созревания биопленки Candida в различных исследовательских условиях с использованием различных грибковых штаммов.