Измерение активности каспазы с помощью флуорометрического анализа или проточной цитометрии
24 марта 2023 г.
Настоящий протокол описывает два метода измерения активности каспазы через фторогенный субстрат с использованием проточной цитометрии или спектрофлуорометра.
Этот протокол позволяет исследователям определить, происходит ли активность каспазы в сочетании с гибелью клеток, тем самым идентифицируя различные способы гибели клеток. Преимуществом этого метода является гибкость для оценки активности каспазы в популяционном анализе или одной клетке. Продемонстрировать процедуру будут Стефани Руфли, аспирант, и Цзин Тонг, приглашенный аспирант из лаборатории Венди Вей-Линн Вонг.
После дифференцировки и сбора макрофагов или BMDM, полученных из костного мозга, как описано в рукописи, посейте их в шестилуночную пластину с плотностью от одного раза 10 до шестого количества клеток на миллилитр. Обрабатывайте клетки миметиком SMAC в течение 16 часов. Чтобы приготовить лизат клеток, перенесите пластину, содержащую обработанные клетки, на лед и соберите питательную среду клеток в 1,5-миллилитровую трубку.
Центрифуга при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте среду и положите трубку на лед. Затем добавьте один миллилитр холодного PBS в пластину для культивирования клеток, чтобы промыть клетки.
После аспирации всех PBS добавьте в клетки 100 микролитров трипсина. Как только клетки отсоединятся от пластины, соберите их в 1,5-миллилитровую трубку. После центрифугирования клеточной суспензии удаляют надосадочный агент и повторно суспендируют гранулу в буфере лизиса DISC объемом 100 микролитров.
Инкубируйте образец на льду в течение 20 минут, а затем центрифугируйте лизат, чтобы гранулировать нерастворимую фракцию. Перенесите 25 микролитров лизата на белую плоскодонную 96-луночную пластину для анализа активности каспазы-3/7 и 10 микролитров на прозрачную плоскодонную 96-луночную пластину для анализа бицинхониновой кислоты или BCA. Для количественной оценки белка подготовьте ряд концентраций бычьего сывороточного альбумина или BSA в качестве стандартного белка.
После добавления стандартного BSA к плоскодонной 96-луночной пластине, содержащей образцы, смешайте реагенты BCA один и два в соотношении 50 к одному и добавьте 200 микролитров к каждому образцу в стандарте. После инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут измерьте поглощение на 562 нанометрах на флуорометрическом приборе и количественно оцените концентрацию белка с помощью стандартной кривой. Чтобы выполнить популяционный анализ, запустите флуорометрический инструмент и нагрейте машину до 30 градусов по Цельсию.
Установите длину волны возбуждения и излучения на 360 и 465 нанометров соответственно. Затем приготовьте мастер-реакционную смесь на льду, как описано в рукописи, чтобы определить активность каспазы. Добавьте 75 микролитров смеси к каждому образцу и стандарту, чтобы получить общий реакционный объем 100 микролитров.
Немедленно измерьте флуоресценцию с помощью флуорометрического прибора и записывайте отдельные показания каждую минуту в течение 40 минут, чтобы определить кинетику реакции. После посева соберите адгезивные ячейки, как было продемонстрировано ранее, в пятимиллилитровую полистирольную трубку. Затем центрифугируйте образец при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите супернатант.
Для приготовления окрашивающей смеси берут один микролитр фторогенного субстрата и разбавляют его 150 микролитрами PBS. Добавьте 50 микролитров окрашивающей смеси на образец, высиживайте ее в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут и перемешивайте каждые 15 минут. В этом популяционном анализе репрезентативные данные кинетического анализа активности каспазы-3/7 показали увеличение расщепления субстрата с увеличением миметической концентрации SMAC.
Однако увеличение на 500 наномолярной концентрации было незначительным на основе обычной односторонней ANOVA с множественными сравнениями. Анализ активности каспазы-3/7 с использованием проточной цитометрии показал сдвиг флуоресценции для клеток, обработанных миметиками SMAC, по сравнению с необработанными клетками, что также было очевидно в построенной средней интенсивности флуоресценции и увеличение при 500 наномолярной концентрации было значительным. Процедура должна проводиться на льду.
Однако в популяционном анализе образцы нельзя оставлять на льду бесконечно. После стадии лизиса образцы должны быть дополнительно обработаны или немедленно заморожены. Визуализация активности каспазы с использованием микроскопии живых клеток будет дополнительным методом получения кинетической информации на уровне одной клетки.
Обзор
В данном протоколе описаны методы измерения активности каспаз с помощью проточной цитометрии или спектрофлуориметра, что позволяет исследователям оценивать механизмы гибели клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследование апоптоза
Теоретическая часть
- Каспазы играют важнейшую роль в процессе апоптоза.
- Понимание активности каспаз помогает в идентификации различных механизмов гибели клеток.
- Данный протокол обеспечивает гибкость при проведении анализа как популяций клеток, так и отдельных клеток.
- Для измерений используются методы проточной цитометрии и спектрофлуориметрии.
Цель исследования
- Для измерения активности каспаз-3/7 в ответ на воздействие препаратов.
- Для дифференциации способов гибели клеток.
- Для обеспечения надежного метода количественного определения концентрации белка.
Используемые методы
- Сбор и обработка макрофагов, полученных из костного мозга (BMDMs).
- Использование флуорогенных субстратов для анализа активности каспаз.
- Применение проточной цитометрии для анализа сдвигов флуоресценции.
- Проведение BCA-анализа для количественного определения белков.
Основные результаты
- Повышенная активность каспаз наблюдалась при более высоких концентрациях миметика SMAC.
- Проточная цитометрия выявила значительные сдвиги флуоресценции в обработанных клетках.
- Популяционные анализы позволили получить кинетические данные об активности каспаз.
- Результаты показали важность незамедлительной обработки образцов после лизиса.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно измерять активность каспаз в исследованиях гибели клеток.
- Он дает представление о кинетике апоптоза.
- Микроскопия живых клеток может углубить понимание динамики каспаз.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Количественное измерение активности каспаз имеет решающее значение для снижения рисков на ранних этапах разработки лекарственных препаратов, направленных на пути гибели клеток. Данный протокол позволяет проводить надежную оценку механизмов апоптоза и пироптоза, что обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишени и проведении механистических исследований. Достоверные результаты анализа каспаз помогают в принятии решений по формированию портфеля препаратов, уточняя степень активации сигнальных путей и эффекты соединений в системах, релевантных для конкретного заболевания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать активацию путей апоптоза и пироптоза в ответ на воздействие молекул-кандидатов.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественного определения активности каспаз в соответствующих типах клеток.
- Способствует снижению механистических рисков за счет дифференциации способов гибели клеток.
- Предоставляет прикладные данные для приоритизации мишеней на основе вовлечения конкретных путей.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает стандартизированные количественные показатели активности каспаз с использованием флуориметрических платформ и платформ проточной цитометрии.
- Поддерживает воспроизводимость и масштабируемость анализа для популяционного и одноклеточного анализа.
- Позволяет проводить скрининг библиотек соединений для поиска модуляторов программируемой гибели клеток.
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующего механистического или фенотипического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет исследование путей гибели клеток с моделями макрофагов, релевантными для конкретных заболеваний.
- Обеспечивает преемственность процессов — от открытия до доклинической валидации агентов, модулирующих апоптоз.
- Поддерживает риск-ориентированное продвижение исследований путем связывания активности каспаз in vitro с трансляционными конечными точками.
- Позволяет разрабатывать биомаркеры для специфических сигнатур гибели клеток в рамках конкретных путей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ активности каспаз интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, поддерживая как ранние исследования механизмов, так и последующие трансляционные исследования.
- Биология открытий: Количественно определяет активацию каспаз по конкретным путям для проверки терапевтических гипотез и уточнения механизмов гибели клеток.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для оценки соединений как в формате общего анализа (bulk), так и на уровне отдельных клеток.
- Аналитика: Позволяет проводить кинетические измерения и измерения конечной точки, что способствует статистическому сравнению условий обработки.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты, полученные in vitro, с моделями соответствующих заболеваний и потенциальными стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает гибкий, не зависящий от платформы метод анализа, который можно адаптировать для различных типов клеток и программ поиска новых лекарств.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и уменьшает неопределенность механизмов в исследованиях гибели клеток.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы измерения активности каспаз для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости между различными исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), уточняя влияние соединений на пути программируемой гибели клеток.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов, модулирующих апоптоз.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, проточной цитометрией и организацией флуорометрического анализа.
- Необходим доступ к спектрофлуориметрам, проточным цитометрам и инфраструктуре для количественного определения белков.
- Требуется строгая стандартизация контролей и анализа данных между исследовательскими группами.
- Метод применим к различным типам клеток, однако может потребоваться оптимизация для разных биологических систем.
- Обработка образцов должна проводиться своевременно для сохранения активности каспаз и целостности анализа.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Seeding, Cell Treatment, and Preparation of Cell Lysate
2:10
BCA Assay for Protein Quantification
2:49
Population-Based Assay for Caspase-3/7 Activity
3:31
Single-Cell Assay for Caspase-3/7 Activity
4:07
Results: Smac Mimetic-Induced Effect on Caspase-3/7 Activity
4:50
Conclusion
