Динамическая многопараметрическая оценка функции тромбоцитов с помощью емкостного биосенсора

Мы разрабатываем анализ для оценки функции тромбоцитов в физиологических условиях, чтобы устранить ограничение текущих анализов путем активации тромбоцитов в полужесткой микросреде с помощью датчика мембранной емкости. Анализ измеряет количество тромбоцитов, силу стимуляции и пути активации. Этот инструмент предлагает комплексный подход к изучению механизмов тромбоцитов во время гемостаза.

Наш протокол позволяет оценить несколько параметров тромбоцитов в одном анализе в физиологических условиях. Мы сосредоточимся на совершенствовании этого протокола и разработке других датчиков оценки гемостаза. Начните с использования стандартного программного обеспечения для компоновки САПР для проектирования компоновки мембранной емкостной микросхемы (MCC) для четырехдюймовой кремниевой подложки для процесса микропроизводства, как описано в рукописи.

Для биофункционализации очистите чувствительный электрод TMCC с помощью кислородной плазмы в течение 45 секунд при мощности 100 Вт. Добавьте один раствор Do Decanal в 200-градусном этаноле в лунку для проб на TMCC. Поместите TMCC в контейнер, наполненный сухим азотом.

Закройте контейнер и оберните его парапленкой на срок от 24 до 48 часов. Через два дня промойте золотую поверхность TMCC деионизированной водой и этанолом 200 пробы. Высушите TMCC газообразным азотом при комнатной температуре.

Добавьте раствор фибронектина человека в PBS в лунку для образцов TMCC и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение от двух до восьми часов. Для настройки емкостного датчика используйте измеритель LCR с микропозиционерами и игольчатыми щупами для установления электрического контакта с датчиком. Используйте напечатанные на 3D-принтере пластиковые приспособления для надежного размещения TMCC и BMCC.

Убедитесь, что нижнее приспособление оснащено стопорами на оси XY, чтобы точно выровнять TMCC над BMCC, образуя конденсатор. Подайте синусоидальный сигнал напряжением 0,5 вольта на частоте 100 килогерц с частотой дискретизации восемь герц. Чтобы получить концентрированную обогащенную тромбоцитами плазму, или CPRP, центрифугируйте образцы крови человека.

Переложите ХППГ в стерильный контейнер и проведите подсчет тромбоцитов. Для исследований ингибиторов инкубируйте CPRP с заранее определенной концентрацией аспирина в буфере Тайрода. Для функционального анализа тромбоцитов соберите TMCC и BMCC в приспособлениях, напечатанных на 3D-принтере.

Измерьте исходную емкость собранных ЦУП в течение пяти минут, затем добавьте 45 микролитров CPRP в лунку для образца в TMCC и подождите 30 минут, чтобы тромбоциты прилипли к покрытому фибронектином электроду в TMCC. Далее удалите 30 микролитров CPRP из лунки образца, не нарушая прилипшие тромбоциты, и пополните лунку буфером Tyrode. После последней промывки добавьте 10 микролитров раствора агониста в нужной концентрации и уравновесьте образец в течение 80 минут.

Измерьте максимальное изменение емкости после 30-минутной адгезии, чтобы определить адгезию дельта С. Для фазы активации измерьте максимальное изменение емкости, называемое активацией дельта C. Рассчитайте наклон кривой емкости между 200 и 300 секундами после активации, чтобы определить активацию S.

Выполняйте статистический анализ с использованием дисперсионного анализа с помощью послеоперационного теста Тьюки для сравнения результатов между группами. Используйте метод Шапиро-Уилка для проверки нормального распределения. Раствор CPRP с заданным количеством тромбоцитов показал линейное снижение емкости во время адгезии.

Экспоненциальное снижение равновесного состояния наблюдалось после активации тромбина. Значения адгезии дельта С показали сильную корреляцию с количеством тромбоцитов в диапазоне количества тромбоцитов, со значительным снижением концентрации аспирина на 1,3 ммоль. Скорость экспоненциального снижения емкости после стимуляции тромбоцитов увеличивалась с концентрацией клеток.

Величина потери емкости также росла с более высокими концентрациями, демонстрируя четкую тенденцию к росту активации дельта С. Аналогичная тенденция наблюдалась в отношении активации S и количества тромбоцитов. С увеличением дозы аспирина емкость, активация дельта С и активация S показали тенденцию к снижению.

Статистически значимая разница в активации S наблюдалась между высокими и средними дозами, в то время как в активации дельта С не было обнаружено существенной разницы. Емкостные сигналы для образцов ХТРЗ, активированных тромбином, показали, что снижение емкости становилось более выраженным с увеличением концентрации тромбина. Как дельта-С-активация, так и S-активация демонстрировали статистически значимую тенденцию к уровню тромбина.