Бесклеточный дот-блот как практичная и адаптируемая платформа иммуноферментного анализа для выявления ответа антител в сыворотке крови человека и животных

Этот протокол демонстрирует метод бесклеточной точечной крови, адаптируемую, доступную и недорогую платформу иммунологического анализа, разработанную в ответ на пандемию COVID-19. Существующие методы иммунологического анализа «золотого стандарта» включают вариации метода ИФА и анализа бокового потока. Существует значительный интерес к разработке новых иммунологических анализов с использованием таких технологий, как расщепленные белки, электрохимические интерфейсы и коллоидные наночастицы.

Проблема заключается в том, что большинство иммунологических анализов золотого стандарта недоступны для нецентрализованных сообществ из-за зависимости от дорогостоящих и сложных молекулярных компонентов и оборудования. Этот новый метод иммунологического анализа CFDB может быть быстро адаптирован к возникающим вспышкам. Он использует базовое лабораторное оборудование и полностью полагается на молекулярные компоненты, которые могут быть произведены внутри компании и в условиях ограниченных ресурсов.

Для начала получите последовательность белка из базы данных UniProt, используя код доступа P0DTC9. Код на оптимизацию последовательности для выражения на основе ecoli с помощью инструмента оптимизации кода IDT. Вставьте оптимизированную последовательность в шаблон SnapGene для основы экспрессионной конструкции, прежде чем заказывать оптимизированную последовательность для коммерческого синтеза в виде одноцепочечного фрагмента ДНК, суспендированного в воде.

Проведите первоначальный тест экспрессии в масштабе пяти микролитров, добавив 10% продукт ПЦР в бесклеточную реакцию ecoli BL21 в пробирке для ПЦР. Инкубируйте реакцию без встряхивания при температуре 30 градусов Цельсия в течение 15 часов. Оцените качество экспрессии нуклеокапсидного белка или NP-антигена, загрузив один микролитр бесклеточной реакции в 12%-ный гель SDS и перенеся его на нитроцеллюлозную мембрану для вестерн-блоттинга.

Соберите бесклеточную реакцию в масштабе одного миллилитра с использованием 15-наномолярного очищенного линейного экспрессионного шаблона для бесклеточного точечного блот-анализа Инкубируйте смесь экспрессии в конической пробирке объемом 15 миллилитров с встряхиванием при 80 об/мин в течение 15 часов при 30 градусах Цельсия. После оценки качества сцеживания с помощью вестерн-блоттинга и аликвотирования 50 микролитров смеси сцеживания, храните аликвоты при температуре минус 20 градусов Цельсия. Используйте основное изображение сетки, как показано на рисунке, с рисунком шесть на шесть сантиметров, содержащим 12 на 12 кругов каждый диаметром два миллиметра, разработанным в соответствии с пятнистостью 96-луночного планшета.

После печати мастер-сетки плотно закрепите напечатанную сетку между двумя слоями клейкой потолочной пленки для ПЦР-пластины, разрежьте сэндвич по размеру по внешним границам сетки. С помощью двухмиллиметрового пробойника для биопсии выдолблите каждый отмеченный круг на сетке. Отрежьте кусок нитроцеллюлозной мембраны размером 6,5 на 6,5 сантиметров, расположите его под главной сеткой на чистой поверхности и закрепите с помощью скотча.

С помощью маркера отметьте крайние положения кругов на нитроцеллюлозной мембране, которые будут использоваться в качестве ориентира для разрезания мембраны после выделения образца. Разбавьте образцы сыворотки от одного до 10 PBS. С помощью микропипетки распределите в три раза 0,4 микролитра каждого образца на нитроцеллюлозную мембрану в заранее определенных положениях сетки.

Дайте пятнистым образцам скрепиться и высохнуть при температуре окружающей среды в течение 10 минут. С помощью пинцета аккуратно извлеките нитроцеллюлозную мембрану и разрежьте ее по отмеченным наружным кругам. Перенесите мембрану в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров блокирующего раствора.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, осторожно встряхивая при 100 об/мин. Достаньте из морозильной камеры 50 микролитров аликвоты смеси для экспрессии бесклеточного антигена и, после размораживания, добавьте ее к пяти миллилитрам блокирующего раствора в 10-сантиметровой чашке Петри. Перенесите мембрану непосредственно в этот раствор, содержащий антиген, и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа, встряхивая со скоростью 100 об/мин.

Через час промойте и промойте мембрану в TBST, содержащем 0,05% Tween 20. Затем добавьте 10 миллилитров блокирующего буфера, содержащего 10 микрограммов на миллилитр очищенного SpyCatcher, два апекса, два белка, к мембране и поместите мембрану в чашку, содержащую верхушку SpyCatcher. Инкубировать в течение одного часа с встряхиванием при 100 об/мин После промывки мембраны трис-буферным физиологическим раствором или TBS промойте дважды в течение пяти минут в TBST с последующим заключительным промыванием в TBS.

Приклейте и закрепите кусок парапленки на чистой рабочей поверхности рядом с инструментом для блот-визуализации. Удалите лишнюю жидкость, постукивая по мембране и с помощью пинцета, поместите ее поверх парапленки. Немедленно добавьте три миллилитра усиленной хемилюминесценции или раствора ECL поверх мембраны и инкубируйте при комнатной температуре ровно 90 секунд.

После высушивания мембраны путем простирания перенесите ее на совместимый с хемилюминесценцией инструмент визуализации. Используйте функцию анализа изображений прибора для получения интенсивности пятна, в том числе для трех пустых позиций на нитроцеллюлозной мембране. Поддерживайте постоянный объем измерения для каждой точки.

Экспортируйте данные в таблицу, обеспечив правильную маркировку каждой позиции спота. Вычислите среднее значение и стандартное отклонение интенсивностей тройных пятен. Вычтите фон нитроцеллюлозной мембраны из всех измерений образца.

Затем используйте данное уравнение для получения порогового значения для интерпретации положительных или отрицательных результатов. Наконец, нанесите вычтенные данные на гистограмму. Бесклеточный анализ блоттинга был проведен на предварительно охарактеризованном коммерческом человеке Саре, и изображение блота вместе с соответствующей диаграммой интенсивности сигнала представлено на этом рисунке.

С помощью бесклеточного дот-блоттинга были успешно идентифицированы все отрицательные контрольные образцы и большинство положительных образцов. Независимое тестирование бесклеточного анализа точечного блоттинга в Национальной микробиологической лаборатории правильно идентифицировало все 12 отрицательных и 12 положительных образцов пациентов, подтвердив его надежность. Бесклеточный анализ дот-блоттинга также выявил реакцию антител у инфицированного SARS-CoV-2 хомяка Сары, при этом положительные сигналы наблюдались в 18 из 24 образцов после заражения, собранных через пять дней после повторного заражения, в то время как все образцы до заражения оставались отрицательными.