Высокая пропускная способность, абсолютное определение содержания выбранной белка на уровнях тканей, с использованием количественных Dot блот анализ (QDB)

Этот метод можно назвать ИФА на тканевом уровне, чтобы дистанцироваться от традиционного относительного полуколичественного количественного определения содержания белка на клеточном и тканевом уровнях, которое в настоящее время является нормой в исследовательской лаборатории и в области клинической диагностики. Основные преимущества этой методики можно описать тремя словами: высокая пропускная способность, количественные и абсолютные. Если бы мы добавили еще одно слово, то это было бы просто.

Применение этого метода распространяется на область протеомики, в то время как верификация биомаркеров может быть достигнута в формате с высокой пропускной способностью. Этот метод имеет широкое применение в исследовательской и клинической области. Количественное определение количества белка на клеточном и тканевом уровнях в настоящее время все еще примитивно.

Вообще говоря, люди, плохо знакомые с этим методом, не столкнутся с проблемами при изучении этой техники, она довольно проста и требует минимальных лабораторных навыков для выполнения. Мы рады продемонстрировать его надежность, простоту и точность техники на животной модели. Образцы могут быть подготовлены любым традиционным методом подготовки образцов с использованием любых буферов для лизиса, обычно используемых в исследовательской лаборатории, с моющим средством, таким как MP40 или Triton, или без него, X.In нашем случае мы используем буфер для лизиса Triton X.

Поместите кусочек ткани от пяти до 100 миллиграммов в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Далее добавьте 200 микролитров лизисного буфера, дополненного ингибиторами протеазы и фосфатазы. Далее гомогенизируйте ткань гомогенизатором в течение одной минуты на льду.

Затем центрифугируйте образец в течение 10 минут при 8 000 умноженных на g при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в новые пробирки и выньте один микролитр для измерения общего количества белка в лизате белка с помощью набора для определения белка, такого как анализ BCA. Инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, затем измерьте поглощение на 562 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов.

На этом этапе, используя рекомбинантный белок с известной концентрацией в качестве стандарта, разбавляют белок до концентрации 12 000 пикограмм на микролитр в виде исходного раствора. Тем временем разведите подготовленный образец лизаты до четырех микрограмм на микролитр. Для получения более надежных результатов мы рекомендуем использовать смесь лизатов образцов, чтобы избежать различий между отдельными образцами.

Серийно разводите как стандартный белок, так и подготовленные образцы для исследования типичной дозы. В состав БСА добавляли для обеспечения примерно равного количества белка для каждого образца. После этого смешайте 10 микролитров серийно разведенного стандартного белка или лизатов образца с 10 микролитрами загрузочного буфера 2X.

Затем нагрейте смесь до 85 градусов Цельсия в течение пяти минут. В этой процедуре поместите пустую коробку с наконечником для пипетки под пластину QDB так, чтобы нижняя часть пластины не касалась поверхности стола. Загрузите до двух микролитров образца в центр мембраны в нижней части отдельного блока планшета QDB.

Никогда не допускайте, чтобы нижняя часть пластины QDB касалась какой-либо поверхности во время загрузки и не нагружайте слишком много для отдельного колодца. По нашему опыту, не более четырех микролитров на лунку. Затем оставьте загруженную пластину QDB на один час при комнатной температуре или оставьте заряженную при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут в хорошо проветриваемом помещении.

Чтобы заблокировать пластину, опустите пластину QDB в буфер для переноса и осторожно встряхните ее в течение 10 секунд. После этого осторожно промойте пластину QDB с TBST три раза, а затем промойте тарелку в течение пяти минут в TBST под постоянным встряхиванием. Затем заблокируйте пластину QDB блокирующим буфером на один час при постоянном встряхивании.

Теперь разведите первичное антитело в блокирующем буфере в выбранной концентрации и добавьте его по 100 микролитров в каждую отдельную лунку обычного 96-луночного планшета. Вставьте планшет QDB в планшет на 96 лунок и инкубируйте объединенные планшеты либо в течение двух часов при комнатной температуре, либо в течение ночи при четырех градусах Цельсия при постоянном встряхивании. После этого осторожно промойте тарелку с TBST три раза, прежде чем она будет промыта TBST три раза, каждый раз в течение пяти минут при постоянном встряхивании.

Далее разведите вторичное антитело в блокирующем буфере в выбранной концентрации и аликвотируйте 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем инкубируйте планшет QDB внутри загруженного 96-луночного планшета в течение одного часа при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Осторожно промойте пластину QDB три раза с TBST, а затем промойте тарелку три раза по пять минут с TBST при постоянном встряхивании.

Для количественного определения подготовьте субстрат ECL и аликотируйте его в 96-луночный планшет по 100 микролитров на лунку. Затем вставьте планшет QDB внутрь 96-луночного планшета на две минуты при постоянном встряхивании. После этого снимите планшет QDB с 96-луночной пластины и кратковременно встряхните, чтобы удалить лишнюю жидкость.

Впоследствии поместите пластину на белую пластину с микротитрованием. Затем включите считыватель микропланшетов и выберите пластину с крышкой в пользовательском интерфейсе, прежде чем помещать комбинированные пластины внутрь считывателя микропланшетов для количественной оценки. Убедитесь, что вы выбрали тарелку с крышкой, чтобы избежать ошибок.

На этом рисунке показана специфичность антител к CAPG кроликов с использованием лизатов тканей мыши, полученных из селезенки, сердца, мышц, почек, печени и предстательной железы с помощью вестерн-блоттинга. Определен линейный диапазон QDB-анализа анти-CAPG антител кроликов с использованием лизатов, полученных из предстательной железы, почек, селезенки, и с использованием очищенного рекомбинантного белка CAPG стандарта. Результаты были в среднем тройными.

Здесь показано абсолютное определение уровня CAPG в лизатах, полученных из почек, селезенки и простаты мыши. После освоения этой техники ее можно выполнить за 4-24 часа, если она выполнена правильно. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о необходимости использовать заранее определенные специфические антитела на протяжении всей процедуры.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как биостатистический анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, достижимые только путем абсолютного измерения содержания отдельных белков на клеточном или тканевом уровне. С момента своего развития этот метод проложил путь исследователям в области исследований протеомики к изучению предполагаемой связи белковых биомаркеров с различными заболеваниями на популяционном уровне. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять анализ QDB в формате с высокой пропускной способностью.

Не забывайте, что работа с тканями человека или животного может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток.