Простой и эффективный метод тестирования иммуномодулирующих агентов для получения толерогенных дендритных клеток из моноцитов CD14⁺ человека

Мы стремимся понять, какие иммуномодулирующие методы лечения могут генерировать переносимые дендритные клетки из уже дифференцированных дендритных клеток, полученных из моноцитов, и это очень ценно для аутоиммунных и трансплантационных исследований. Самолечение становится все более практичным благодаря достижениям в производстве, а толерогенные дендритные клетки показали многообещающие результаты в доклинических исследованиях. Они могут генерировать толерантность к антигену. Наиболее распространена цитометрия. Это обеспечивает быстрый и доступный способ анализа переносимых клеток. Сложно создать толерогенные дендритные клетки, которые сохраняются в обоих функциях in vivo. Вот почему не существует клинически одобренных методов лечения дендритными клетками для переносимых. Мы идентифицировали новые комбинации иммуномодулирующих соединений в крупных скрининговых исследованиях, которые демонстрируют улучшение переносимой функциональности дендритных клеток. Мы также разрабатываем рецептуры с переносимостью наночастиц.

[Инструктор] Для начала поместите 15 миллилитровые пробирки, содержащие обогащенные моноциты человека и Т-клетки, в центрифугу. После завершения центрифугирования с помощью пипетки отсасывайте надосадочную жидкость из пробирок. Добавьте один миллилитр питательной среды MODC к грануле моноцитов, один миллилитр питательной среды Т-клеток в пробирку с Т-клетками и хорошо перемешайте перед подсчетом клеток. Далее добавьте девять миллилитров теплой питательной среды MODC в моноцитарную суспензию, чтобы получить итоговый объем в 10 миллилитров. Затем пипетку по 100 микролитров из стоковых растворов GM-CSF и IL-4. Переложите суспензию в чашку Петри с маркировкой, помеченную как MODC, и инкубируйте. Далее добавьте в суспензию Т-клеток один миллилитр замораживающей среды для Т-клеток. Разделите смесь на два криофлана объемом два миллилитра. Поместите запечатанные криопробирки в морозильную камеру с балансировочными пробирками в неиспользуемые лунки. На четвертый день добавьте пять миллилитров свежей питательной среды MODC в моноцитарную пробирку. Затем пипетку по 100 микролитров из серийных растворов GM-CSF и IL-4 семь и инкубировать до седьмого дня. На седьмой день перенесите дифференцированные дендритные клетки, полученные из моноцитов, или MDOC, в 50-миллилитровую пробирку и центрифугуйте, как и раньше. Добавьте один миллилитр теплой питательной среды MODC в клеточную гранулу и пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Разбавляют суспензию теплой питательной средой MODC, содержащей GM-CSF и IL4, до получения желаемой концентрации клеток. Дозируйте 100 микролитров суспензии, содержащей 30 000 клеток, в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования тканей с плоским дном. Добавьте один микролитр иммуномодулирующих препаратов в предназначенные для этого лунки и инкубируйте. На следующий день центрифугируйте планшет MODC при 300 G в течение пяти минут. Аккуратно удалив надосадочную жидкость, аккуратно добавьте 200 микролитров теплого HBSS на боковую сторону планшета и центрифугируйте. Снова добавьте 100 микролитров теплой питательной среды MODC, содержащей GM-CSF и IL4, после аспирации надосадочной жидкости. Если используется иммуностимуляция, добавьте в предназначенные лунки один микролитр 100-кратного запаса липополисахарида и инкубируйте. На восьмой день разморозьте два криофлакона в горячей ванне с шариками при температуре 37 градусов Цельсия, пока содержимое не начнет плавиться. После частичного размораживания переложите флаконы в колпак для клеточных культур. Затем добавьте один миллилитр теплой Т-клеточной культуры среды, чтобы быстро разморозить клетки. Переложите содержимое в пробирку объемом 50 миллилитров и промойте криопробирки дополнительным одним миллилитром среды для культуры Т-клеток, чтобы собрать все клетки. Долить в суспензию раствор для окрашивания потоком до 15 миллилитров и центрифугировать. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах проточного окрашивающего раствора и снова центрифугируйте, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре теплой среды для культуры Т-клеток после пипетирования надосадочной жидкости. Добавьте девять миллилитров теплой питательной среды для Т-клеток, чтобы получить окончательный объем в 10 миллилитров. Переложите суспензию в чашку Петри с маркировкой «Размороженные Т-клетки» и инкубируйте. На восьмой день центрифугируйте планшет MODC при 300 G в течение пяти минут. После дозирования надосадочной жидкости добавьте в каждую лунку по 200 микролитров раствора для окрашивания потоком и инкубируйте. Затем пипеткой вверх и вниз удаляйте прикрепленные клетки и суспензию клеток на новую 96-луночную V-образную пластину, прежде чем снова центрифугировать. Пипеткой введите 50 микролитров антитела ингибитора связывания FC-рецептора в каждую лунку после аспирации надосадочной жидкости для блокирования неспецифического связывания. После инкубации планшета при комнатной температуре в течение 30 минут добавьте в каждую лунку по 50 микролитров приготовленного коктейля антител валидационной панели. Смешайте 50 микролитров компенсационных шариков с 50 микролитрами каждого разведенного антитела в пробирках объемом 1,5 миллилитра и инкубируйте. Центрифугируйте планшет при 300 G в течение пяти минут. Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах проточного красящего раствора для промывания ячеек. После окончательной промывки и центрифугирования повторно суспендируйте клетки в 110 микролитрах проточного окрашивающего раствора для проточного цитометрического анализа. Для толерогенных MODC замените коктейль антител коктейлем панели толерантности. На девятый день переложите размороженную чашку Петри с Т-клетками в 50-миллилитровую пробирку и долейте пробирку раствором для окрашивания потоком. Используйте вторую пробирку, содержащую неокрашенный Т-элемент, для тригонометрического анализа. Вращайте трубки при температуре 250 G в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте клетки в теплых средах для культивирования клеток. Подсчитайте количество Т-клеток и убедитесь, что получено не менее 4 миллионов клеток. Центрифугируйте планшет MODC при 300 G в течение пяти минут. После аспирации надосадочной жидкости добавьте в каждую лунку по 200 микролитров Т-клеток. Добавьте неокрашенные Т-клетки для планшетов для тригонометрического анализа. Добавьте 25 микролитров на миллилитр коктейля анти-CD3/CD28 антител во все группы, кроме отрицательных контрольных лунок для стимуляции Т-клеток и инкубируйте до 12 дня. Затем перенесите все клеточные суспензии из 96-луночного планшета в планшет с V-образным дном с раствором для окрашивания потоком. Промойте ячейки дважды в 200 микролитрах проточного раствора для окрашивания. Отложите несколько ячеек для управления компенсацией. После второй промывки центрифугируйте пластину. Затем добавьте в каждую лунку по 50 микролитров разведенного антитела ингибитора связывания рецепторов ФК и инкубируйте. Когда инкубация будет завершена, добавьте в каждую лунку по 50 микролитров приготовленного коктейля антител тригонометрической панели. Для контроля компенсации смешайте 50 микролитров неокрашенных компенсационных клеток с 50 микролитрами каждого окрашенного антитела. Инкубируйте планшет и регуляторы компенсации при четырех градусах Цельсия в течение одного часа, затем промойте раствором для окрашивания потоком перед центрифугированием. Теперь окрашивайте клетки красителем Live/Dead Near-IR, разведенным в HBSS в количестве 200 микролитров на лунку перед холодной инкубацией. Промойте и центрифугируйте планшет перед окрашиванием с помощью Fox P3 и проточного цитометрического анализа. В первый день недифференцированные моноциты имели преобладание HLA-DR-минус с небольшим CD14 минусом, в то время как дифференцированные моноциты на седьмой день показали большинство клеток как HLA-DR-плюс CD14 минус, CD1c-плюс, CD141 плюс. Лечение рапамицином как с липополисахаридом, так и без него, значительно снижало популяции DC-SIGN-plus CD1c-plus и ингибировало повышение регуляции маркеров CD86 и CD40, наблюдаемое при лечении только ЛПС. Популяции регуляторных клеток FOX P3-plus T были увеличены при совместном культивировании MDC с Т-клетками. Но существенных различий между четырьмя группами лечения MODC не наблюдалось. Пролиферация Т-клеток была снижена в популяциях CD4-plus и CD8-plus Т-клеток после кокультивирования с MDOC, обработанными Rapa. Обработанные образцы интерлейкина-10 значительно увеличивали выработку интерлейкина-10 через 24 часа. MDOC, обработанные Dex, значительно увеличивали выработку интерлейкина-10, но только после отдыха в течение 72 часов. Предварительная обработка дексаметазоном снижала среднюю генерацию альфа-ФНО при лечении ЛПС через 24 часа. Значительное увеличение PDL1-plus MDOC наблюдалось в группах, получавших Dex плюс LPS и Rapa, через 72 часа. Подавление экспрессии CD86 наблюдалось во всех группах, получавших иммуномодуляторы, как через 24, так и через 72 часа. MDOC, обработанные иммуномодуляторами, не увеличивали пролиферацию CD4-plus Т-клеток.