Моделирование стойкой инфекции Pseudomonas aeruginosa у раненых личинок данио-рерио

Хроническая инфекция, вызванная бактерией Pseudomonas aeruginosa, толерантна к антибиотикам и очень плохо поддается лечению. Наша цель состоит в том, чтобы разработать модель in vivo, которая ускорит открытие эффективных методов лечения. Антибактериальные препараты в основном проверяются in vitro, и тестирование лекарств на хронически инфицированных мышах представляет собой сложную задачу. Чтобы заполнить пробел между этими двумя подходами, мы предлагаем альтернативную доклиническую модель с использованием раненых личинок данио-рерио. Наша модель персистирующей инфекции у рыбок данио, основанная на использовании клинического штамма Pseudomonas aeruginosa, воспроизводит толерантность к антибиотикам. В то время как микроинъекции обычно используются для заражения личинок рыбок данио, наш метод ранения отражает естественный способ заражения и хорошо подходит для скрининга терапевтических соединений.

[Рассказчик] Для начала поместите иглы 25-го калибра поверх двух палочек для еды, чтобы облегчить обращение. С помощью стереомикроскопа можно выявить и удалить эмбрионы, которые демонстрируют аномальное развитие или являются нежизнеспособными. Двигайте чашку круговыми движениями, чтобы собрать оставшиеся эмбрионы в центре. Теперь используйте две вертикально ориентированные иглы, чтобы изолировать каждый эмбрион, расположив левую иглу в хвосте, чтобы тело оставалось прямым. Правой иглой сделайте одинарный надрез по краю хорды, чтобы удалить плавник. Выполняйте каждый разрез быстро, гарантируя, что все эмбрионы будут погружены в бактериальный раствор в течение 10 минут. Для процедуры заражения раствор Pseudomonas aeruginosa помещают в шкаф биологической безопасности второго типа и добавляют его примерно в 10 раз в объеме семи колониеобразующих единиц на миллилитр в шестилуночный планшет. С помощью одноразовой стеклянной пастеровской пипетки соберите раненые эмбрионы и перенесите их в бактериальный раствор. Инкубируйте шестилуночный планшет при температуре 28 градусов Цельсия в течение 1,5 часов. После инкубации извлеките зараженные эмбрионы и поместите их под микробиологическую безопасность для промывки. Теперь перенесите эмбрионы стеклянной пипеткой в 10 миллилитров воды для рыб без метиленового синего, минимизировав переносимый объем и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем снова перенесите эмбрионы стеклянной пипеткой в четыре миллилитра рыбьей воды без метиленового синего и коротко инкубируйте. Далее с помощью пипетки перенесите зараженные эмбрионы по отдельности в 24-луночную пластину, добавив в каждую лунку по одному миллилитру рыбьей воды без метиленового синего. Поместите планшет на 24 лунки в инкубатор, установленный при температуре 28 градусов Цельсия. Приготовьте 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки с 95 микролитрами 1X PBS для каждой зараженной личинки. Переложите личинок в шестилуночную тарелку, содержащую четыре миллилитра рыбьей воды без метиленового синего для промывки и удаления планктонных бактерий. Поместите каждый промытый эмбрион в микроцентрифужную пробирку с PBS, пропуская как можно меньше жидкости. Теперь с помощью пестика раздавите каждый эмбрион о стенку микроцентрифужной пробирки, оставив пестик внутри пробирки. Затем поднимите пестик и добавьте 100 микролитров 2% PBS Triton, чтобы смыть остатки бактерий с пестика, достигнув конечной концентрации 1%. Сделайте трубку вихревой и инкубируйте в течение 10 минут. Затем нанесите три капли по 10 микролитров неразбавленного лизата из каждого эмбриона на пластины с агаром LB. Используйте многоканальную пипетку для последовательного разбавления каждого лизата в 96-луночном планшете до 10 в степени разведения минус три. Наконец, нанесите три капли разведения по 10 микролитров рядом с неразбавленными пятнами. И инкубировать в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Все четыре изолята Pseudomonas aeruginosa с муковисцидозом были значительно менее вирулентны в модели поврежденного эмбриона по сравнению с референсным штаммом PAO1. У эмбрионов, инфицированных двумя изолятами, бактериальная нагрузка заметно снизилась в течение трех дней, что указывает на элиминацию бактерий. Напротив, два других изолята, B6513 и RP73, поддерживали относительно стабильную бактериальную нагрузку в течение 18-65 часов после заражения после первоначального снижения, что свидетельствует о персистенции. Короткое 30-минутное лечение тобрамицином через 1,5 часа после заражения резко снизило бактериальную нагрузку у эмбрионов, инфицированных изолятами B6513. Тобрамицин не оказывал существенного влияния на бактериальную нагрузку при введении через 24 или 48 часов после заражения, демонстрируя устойчивость на стадиях персистирующей инфекции.