Простой и быстрый метод одновременного выделения первичных островков и первичных ацинарных клеток поджелудочной железы у мышей

В этом исследовании был разработан упрощённый метод эффективного извлечения функциональных первичных островков и ацинарных клеток из поджелудочной железы мышей, что является ценным инструментом для изучения внутриклеточной коммуникации в патогенезе острого панкреатита, вызванного сахарным диабетом (PPDMA). Современные методы выделения первичных островков от мышей в основном основаны на каннулировании желчных протоков. Этот метод требует точной локализации и каннулирования желчного протока, после чего происходит in vivo перфузия раствора паренхимы коллагеназы P поджелудочной железы.

Без специализированной подготовки это довольно сложно, а достижение эффективной и результативной перфузии поджелудочной железы — это непросто. Это видео предотвращает простой и быстрый способ выделения первичных островков, подходящих для исследователей без опыта перфузии. Метод также позволяет одновременно приобретать первичные ацинарные клетки поджелудочной железы, обеспечивая достаточное количество высококачественных островков и ацинарных клеток.

Это позволяет исследователям проводить эксперименты в одном патологическом и физиологическом контексте, тем самым облегчая глубокий анализ механизма взаимодействия между островками и ацинарными клетками. Изоляция островков поджелудочной железы и ацинарных клеток поджелудочной железы. Добавьте сбалансированный сольный раствор Хэнка и раствор коллагеназы P на пластину из 12 лунок и добавьте три миллилитра раствора коллагеназы P в 50-миллилитровую центрифугную трубку для последующего переваривания.

Перед операцией унесите мыши 1,25% триброметанола, а затем эвтаназия. Сделайте V-образный разрез на животе, чтобы открыть брюшную полость мыши. Тёмно-красный лимфоидный орган в левой ипохондрической области — это селезёнка, а белый орган, прикреплённый к селезёнке, — поджелудочная железа.

Аккуратно проведите тупую диссекцию поджелудочной железы вдоль нижнего края желудка и в панкреатикодуоденальном соединении. Промыть изолированную ткань поджелудочной железы в сбалансированном соляном растворе Хэнка и удалить остатки прикреплений брыжей, селезёнку и перипанкреатическую жировую ткань. Переместите предварительно обработанную поджелудочную железу в 12-ядровую пластину, добавленную двумя миллилитрами раствора коллагеназы P.

Удерживайте поджелудочную железу пинцетом левой рукой, а правой рукой вводите раствор коллагеназы P в паренхиму поджелудочной железы до тех пор, пока ткань поджелудочной железы не станет прозрачной и отёчной. Быстро разрежьте поджелудочную железу на 1-2 миллиметра кубиками с помощью хирургических ножниц. Отрежьте дистальный кончик пипетки диаметром 1,5 сантиметра для увеличения отверстия и с помощью этого модифицированного наконечника переместите части ткани поджелудочной железы вместе с двумя миллилитрами раствора коллагеназы P в 50-миллилитровую центрифугную трубку, заранее загруженную тремя миллилитрами раствора коллагеназы P.

Инкубировать центрифугную трубку в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12 минут, аккуратно встряхивая трубку каждые пять-шесть минут в этот период. Добавьте 10 миллилитров полной среды RPMI 1640, чтобы прекратить пищеварительный эффект раствора коллагеназы P. Пипетировать гранулу пятимиллилитровой пипеткой Пастера, 15–20 раз вверх и вниз, пока не останется заметных крупных сгустков тканей.

Добавьте 10 миллилитров RPMI 1640 полной среды. Затем центрифугировать при 180 раз по G в течение двух минут при 4 градусах Цельсия. И сбросьте супернатант. Суспензируйте гранулу с 20 миллилитрами RPMI 1640 полной среды.

Фильтруйте подвеску через решето на 40 сеток. Затем центрифугировать при 180 раз по G в течение двух минут при 4 градусах Цельсия. Аккуратно отбрось супернатанта.

Добавьте 20 миллилитров раствора Фиколла для повторной суспензии гранулы. Затем медленно добавляйте 15 миллилитров RPMI 1640 полного среднего. В этот момент можно наблюдать прозрачный жидкий интерфейс.

Аккуратно центрифугуйте при 640 градусах G в течение 20 минут при 25 градусах Цельсия. Аккуратно снимите центрифугную трубку и аспирируйте верхний красный средний слой с помощью пятимиллилитровой пипетки Пастера. Затем аккуратно аспирируйте островки с жидкостью на границе жидкого слоя и передайте их в новую 50-миллилитровую центрифугную трубку.

Добавьте 20 миллилитров RPMI 1640 полной среды. Центрифугировать при 180 раз по G в течение двух минут при 4 градусах Цельсия и отбросить супернатант. Подвесьте гранулу с помощью 20 миллилитров RPMI 1640 полной среды.

Центрифугировать при 180 раз по G в течение двух минут при 4 градусах Цельсия и отбросить супернатант. Повторно подвесьте гранулу с помощью 10 миллилитров RPMI 1640 полной среды. И перенесите её в 60-миллиметровую чашу для клеточной культуры.

Под инвертированным биологическим микроскопом с увеличением в 100 раз вручную выбирайте островки с помощью пипетки объемом 20 микролитров. Перенесите выбранные островки на 24-колодную клеточную культурную пластину, предварительно загруженную 500 микролитрами полной среды RPMI 1640 на каждую скважину. Отбросьте слой решения Фиколла.

Повторно суспензируйте гранулу с помощью 10 миллилитров полного материала DMEM. Профильтруйте через 100-микрометровый фильтр для ячейки. Центрифугу при 180 градусах G в течение двух минут при четырёх градусах Цельсия.

И отбросить супернатант. Повторно суспензируйте гранулу с помощью 10 миллилитров полного материала DMEM. Центрифугировать при 180 раз G в течение двух минут при 4 градусах Цельсия и отбросить супернатант.

Затем взвешивают гранулу пятью миллилитрами полной среды DMEM для последующих экспериментов. После центрифугирования по градиенту плотности раствора Фиколла были обнаружены островки возле границы между прозрачным бесцветным слоем жидкости и средой, при этом на дне трубки присутствовали пакеты в виде осадка. Островки обычно были круглого овального цвета, золотисто-коричневого цвета, со стабильным выходом 120 плюс-минус пять на мышь, на рисунке A и на рисунке B. Недавно выделенные PAC были сферическими и сгруппированными.

Ацинарные клетки имели более тёмные верхушечные концы с видимыми гранулами зимогена, и выход составлял 1,6–1,95 умножить на 10 к седьмым силовым элементам на мышь; на рисунках C и рисунке D. Окрашивание клясеин и ацинарных клеток показывает, что большинство клеток окрашены зелёным кальцеином, живым и небольшим количеством красных PI, мертвыми. Рисунок A. Количественный анализ на основе изображения J показывает, что изолированные островки и ацинарные клетки имеют показатели жизнеспособности 97,52 плюс-минус 0,16% и 96,55 плюс или минус 0,95% соответственно, рисунок B. Выделены ацинарные клетки поджелудочной железы с базальной амилазной активностью 0,79 плюс-минус 0,01 единицы на миллилитр. После стимуляции 10 наномоляров, 20 наномолярных и 50 наномолярных целарулеинов, их амилазная активность составляла 1,45 плюс-минус 0,03 единицы на миллилитр, 1,65 плюс-минус 0,05 единицы на миллилитр и 1,39 плюс-минус 0,02 единицы на миллилитр соответственно. Односторонний ANOVA показал, что все группы целюлеина имели значительно разную активность амилазы по сравнению с контрольной группой, при этом все значения P менее 0,001.

Кроме того, группа 20 наномоляров значительно отличалась от группы 10 наномоляров, значение P меньше 0,001, рисунок A. Изолированные островки с секрецией инсулина 0,27 плюс-минус 0,04 нанограмма на миллилитр на островок в час при стимуляции 5,6 миллимолярной глюкозы и 0,94 плюс-минус 0,04 нанограмма на миллилитр на островок в час при 22 миллимолярной глюкозе, GSI равен 3,44, рисунок B. В этом исследовании был установлен метод одновременной изоляции первичных мышиных островков и ацинарных клеток поджелудочной железы без комплексной перфузии in vivo. С длинным техническим барьером метод прост в использовании, даёт 120 плюс-минус 5 островков и 1,6–1,95 умножение на 10–седьмой степень ацинарных клеток на мышь, при этом оба типа клеток показывают жизнеспособность более 96%. Изолированные островки демонстрируют нормальную глюкозостимулированную секрецию инсулина, а ацинарные клетки чувствительны к стимуляции целулеином. Это подтверждает, что клетки, полученные этим методом, обладают целостными функциями, что делает их подходящими для изучения взаимодействия поджелудочной железы между экзокрином и эндокринным взаимодействием.

Однако метод ограничен необходимостью базовых знаний анатомии мышей, необходимостью корректировки дозировки реагентов, ограничениями на количество обработанных мышей одновременно и риском невалидированного применения. Он по-прежнему обеспечивает надёжный протокол изоляции клеток для исследователей без опыта перфузии.