Выделение и количественная оценка аксональных мРНК с помощью пористых мембранных вставок и RTddPCR
6 февраля 2026 г.
В данном исследовании представлен надёжный метод выделения аксональных мРНК с помощью пористых мембранных вставок, позволяющий полностью разделять нейроны и нейриты и очищать РНК. В сочетании с RTddPCR этот подход позволяет абсолютную количественную оценку транскриптов с низким уровнем копирования, облегчая исследования транспорта мРНК и локального перевода с высокой чувствительностью, воспроизводимостью и широкой экспериментальной применимостью.
Наши исследования изучают, как регулируется локальный синтез белков и какую роль он занимает нейронное восстановление, развитие и дегенерацию. Недавние достижения включают высокочувствительные методы обнаружения мРНК, такие как gdPCR, для выявления аксональных МРНК с низким количеством и разделение нейронных культур. Для начала аликвот 250 микролитров триазола в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку, соответствующую каждой вставке, в одну яме или вставку пластины с шестью лунками.
Держите трубки в стороне до необходимости. Добавьте по два миллилитра стерильного PBS в каждую яме второй шести-пластины, чтобы количество колодец или пластин соответствовало числу вставок. Вытащите культурную среду с верхнего нижнего конца вставки пипеткой и перенесите вставку в пластину с шестью ямками с PBS.
Теперь, используя щипцы, аккуратно положите вставку, затем добавьте сверху два миллилитра PBS. Аспирируйте PBS с обеих сторон и повторяйте промывку дважды. Затем оставьте вставку в свежем PBS.
Затем используйте стерильный скребок для соскребания всей фракции нейрона с верхней части вставки. Соберите сома-лизат из вставка. Пересадите его в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра.
Центрифугуйте лампу при 10 000–15 000 G в течение двух минут. Сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 250 микролитрах тризола. Обозначите эту трубку как долю целого нейрона.
Чтобы собрать нейритную фракцию, медленно двигайте один конец стерильной ватной палочки зигзагообразно сверху вниз по всей нейронной стороне вставки. Поверните вставку на 90 градусов и повторите, используя другой конец тампона. Затем сбросьте мазок.
Используйте новый тампон и двигайтесь по концентрическим кругам, начиная от центра вставки наружу, обязательно очищая окружность. Инвертируйте вставку так, чтобы сторона нейрита была обращена вверх. Разрежьте мембрану новым стерильным лезвием скальпеля.
Поместите вырезанную мембрану в пластину с шестью ямыками, содержащую тризол, с нейритной стороной вниз. Убедитесь, что мембрана погружена под воду. Теперь соберите тризол, содержащий нейрит-лизат, из колодца.
Пересадите его в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра. Продолжите изоляцию РНК или храните лизаты сомы и нейрита при минус 80 градусах Цельсия для последующей обработки. Подготовьте цифровые реакции капель обратной транскрипции с использованием Droplet Digital PCR Ready-to-Use Universal Mix и нацеливайте специфические праймеры с соответствующей комплементарной ДНК.
Пипетировать реакционную смесь в картридж для генерации капель. Затем добавляйте генерирующую нефть в назначенные скважины патрона. Теперь запечатай картридж прокладкой.
Генерируйте капли с помощью генератора капель. После образования капель переложите их в 96-лужинную ПЦР-пластину и запечатайте фольгой, прежде чем поместить пластину в термоциклер. Откройте программное обеспечение QX Manager, чтобы начать анализ.
Нажмите на опцию «Просмотр» и откройте файл для анализа. Когда файл загрузился, на левой панели появляется обзор панели. Выберите интересующие источники, удерживая клавишу Control во время нажатия.
Нажмите на 1D Amplitude, чтобы визуализировать точечный график. Выберите Threshold Multiple Wells, чтобы применить один и тот же порог к нескольким скважинам. Вводим пороговое значение, основанное на том, где видно чёткое разделение между положительными и отрицательными каплями.
Теперь внимательно просмотрите раздел данных, показывающий описание образца, значения концентрации, количество допустимых капель, а также положительные и отрицательные капли. Нажмите «Сохранить», чтобы записать результаты порогового значения. Количественная оценка РНК с помощью рибо-зелёного анализа показала, что целые нейронные партии дают 212,85 нанограмма РНК на вставку, а нейритные фракции — 42,75 нанограмма.
ПЦР-валидация определила первый набор праймеров как наиболее специфичный для транскрипта Gap43, показывая выраженную одну полосу. Неоднозначные результаты ПЦР для гамма-актина побудили провести тест температурного градиента с использованием второго набора праймеров, который показал наибольшее усиление при 55 градусах Цельсия. Амплитудные графики RT-ddPCR показали чёткое разделение капель для гамма-актина как в целом нейроне, так и в образцах нейрита, что подтверждает надёжное обнаружение транскриптов.
Для Gap43 почти 23% пула мРНК присутствует в нейритах, по сравнению с гамма-актином, где в нейритах содержится только 5% пула мРНК по сравнению со всей долей нейрона. Мы показали наличие структур стрессовых гранул в аксонах при физиологических условиях, которые подавляют локальный синтез белков. Наш протокол предлагает надёжный и последовательный метод изоляции нейронных компартментов и обнаружения мРНК в низкой среде.
Будущий анализ будет сосредоточен на выделении и характеристике отдельных аксональных поддоменов, таких как конусы роста и аксональный ствол, выходящие за рамки объёмного анализа.
Обзор
Это исследование представляет надежный метод для изоляции аксональных мРНК с использованием пористых мембранных вставок, позволяющий полное разделение нейронов и нервных отростков и очистку РНК. Метод позволяет абсолютную квантификацию низкокопийных транскриптов, облегчая исследования транспорта мРНК и локальной трансляции с высокой чувствительностью и воспроизводимостью.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Экспрессия генов
- Методы изоляции РНК
Предыстория
- Локальный синтез белков играет решающую роль в восстановлении и развитии нервной системы.
- Высокочувствительные методы обнаружения мРНК необходимы для исследования низкоабундантных аксональных мРНК.
- Понимание транспорта мРНК и локальной трансляции важно для нейробиологических исследований.
- Изоляция нейрональных компартиментов может улучшить исследование экспрессии генов в определенных клеточных контекстах.
Цель исследования
- Разработать метод изоляции аксональных мРНК из нейронов и нервных отростков.
- Обеспечить квантификацию низкокопийных транскриптов с использованием RT-ddPCR.
- Облегчить исследования транспорта мРНК и локальной трансляции в нейронах.
Используемые методы
- Изоляция фракций целых нейронов и нервных отростков с использованием пористых мембранных вставок.
- Очистка РНК с помощью тризол и последующая квантификация.
- Обратная транскрипция капельная цифровая ПЦР (RT-ddPCR) для анализа транскриптов.
- Валидация специфичности праймеров и условий амплификации для целевых транскриптов.
Основные результаты
- Фракции целых нейронов дали 212,85 нанограмов РНК на вставку, в то время как фракции нервных отростков дали 42,75 нанограмов.
- RT-ddPCR показал четкое разделение капель для целевых транскриптов, подтверждая надежное обнаружение.
- Примерно 23% пула мРНК для Gap43 присутствует в нервных отростках, по сравнению с 5% для Gamma-актина.
- Было наблюдено наличие структур стрессовых гранул в аксонах, ингибирующих локальный синтез белков.
Выводы
- Разработанный протокол предлагает надежный метод изоляции нейрональных компартиментов.
- Он позволяет обнаружить низкоабундантные мРНК с высокой чувствительностью.
- Будущие исследования будут сосредоточены на характеристике различных аксональных субдоменов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative isolation of axonal mRNAs using porous membrane inserts and RT-ddPCR enables precise mapping of transcript localization, a critical factor in understanding neuronal function and disease mechanisms. This approach enhances predictive confidence in target validation by providing absolute quantification of low-copy transcripts in distinct neuronal compartments. The method supports translational continuity from early discovery through preclinical research by enabling reproducible, compartment-specific RNA analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of compartment-specific transcript localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying mRNAs involved in axon growth and regeneration.
- Facilitates predictive confidence in neuronal pathway analysis and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuronal systems for downstream screening of RNA-modulating compounds.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative mRNA measurements across compartments.
- Enables high-sensitivity detection of rare transcripts for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling analysis of axonal mRNA changes in response to injury or stress.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation through absolute quantification of localized transcripts.
- Provides mechanistic insights into neuronal repair and degeneration for risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, supporting both target identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of local translation and pathway clarification in neurons.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative outputs for cross-condition comparisons.
- Analytics: Delivers absolute mRNA copy number measurements and robust statistical outputs.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease models and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, adaptable platform for diverse neuronal subtypes and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target validation.
- Operational Value: Standardizes compartment-specific RNA isolation and quantification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling high-sensitivity detection of key transcripts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, RNA isolation, and digital PCR analysis.
- Needs access to porous membrane inserts, droplet digital PCR instrumentation, and analytical software.
- Demands rigorous cross-team standardization to minimize cross-contamination and ensure reproducibility.
- Adaptable to various neuronal subtypes, developmental stages, and injury models as supported by the protocol.
- Practical limitations include the technical challenge of isolating rare axonal mRNAs and the need for validated primers.
