Выделение и количественная оценка аксональных мРНК с помощью пористых мембранных вставок и RTddPCR

Наши исследования изучают, как регулируется локальный синтез белков и какую роль он занимает нейронное восстановление, развитие и дегенерацию. Недавние достижения включают высокочувствительные методы обнаружения мРНК, такие как gdPCR, для выявления аксональных МРНК с низким количеством и разделение нейронных культур. Для начала аликвот 250 микролитров триазола в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку, соответствующую каждой вставке, в одну яме или вставку пластины с шестью лунками.

Держите трубки в стороне до необходимости. Добавьте по два миллилитра стерильного PBS в каждую яме второй шести-пластины, чтобы количество колодец или пластин соответствовало числу вставок. Вытащите культурную среду с верхнего нижнего конца вставки пипеткой и перенесите вставку в пластину с шестью ямками с PBS.

Теперь, используя щипцы, аккуратно положите вставку, затем добавьте сверху два миллилитра PBS. Аспирируйте PBS с обеих сторон и повторяйте промывку дважды. Затем оставьте вставку в свежем PBS.

Затем используйте стерильный скребок для соскребания всей фракции нейрона с верхней части вставки. Соберите сома-лизат из вставка. Пересадите его в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра.

Центрифугуйте лампу при 10 000–15 000 G в течение двух минут. Сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 250 микролитрах тризола. Обозначите эту трубку как долю целого нейрона.

Чтобы собрать нейритную фракцию, медленно двигайте один конец стерильной ватной палочки зигзагообразно сверху вниз по всей нейронной стороне вставки. Поверните вставку на 90 градусов и повторите, используя другой конец тампона. Затем сбросьте мазок.

Используйте новый тампон и двигайтесь по концентрическим кругам, начиная от центра вставки наружу, обязательно очищая окружность. Инвертируйте вставку так, чтобы сторона нейрита была обращена вверх. Разрежьте мембрану новым стерильным лезвием скальпеля.

Поместите вырезанную мембрану в пластину с шестью ямыками, содержащую тризол, с нейритной стороной вниз. Убедитесь, что мембрана погружена под воду. Теперь соберите тризол, содержащий нейрит-лизат, из колодца.

Пересадите его в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра. Продолжите изоляцию РНК или храните лизаты сомы и нейрита при минус 80 градусах Цельсия для последующей обработки. Подготовьте цифровые реакции капель обратной транскрипции с использованием Droplet Digital PCR Ready-to-Use Universal Mix и нацеливайте специфические праймеры с соответствующей комплементарной ДНК.

Пипетировать реакционную смесь в картридж для генерации капель. Затем добавляйте генерирующую нефть в назначенные скважины патрона. Теперь запечатай картридж прокладкой.

Генерируйте капли с помощью генератора капель. После образования капель переложите их в 96-лужинную ПЦР-пластину и запечатайте фольгой, прежде чем поместить пластину в термоциклер. Откройте программное обеспечение QX Manager, чтобы начать анализ.

Нажмите на опцию «Просмотр» и откройте файл для анализа. Когда файл загрузился, на левой панели появляется обзор панели. Выберите интересующие источники, удерживая клавишу Control во время нажатия.

Нажмите на 1D Amplitude, чтобы визуализировать точечный график. Выберите Threshold Multiple Wells, чтобы применить один и тот же порог к нескольким скважинам. Вводим пороговое значение, основанное на том, где видно чёткое разделение между положительными и отрицательными каплями.

Теперь внимательно просмотрите раздел данных, показывающий описание образца, значения концентрации, количество допустимых капель, а также положительные и отрицательные капли. Нажмите «Сохранить», чтобы записать результаты порогового значения. Количественная оценка РНК с помощью рибо-зелёного анализа показала, что целые нейронные партии дают 212,85 нанограмма РНК на вставку, а нейритные фракции — 42,75 нанограмма.

ПЦР-валидация определила первый набор праймеров как наиболее специфичный для транскрипта Gap43, показывая выраженную одну полосу. Неоднозначные результаты ПЦР для гамма-актина побудили провести тест температурного градиента с использованием второго набора праймеров, который показал наибольшее усиление при 55 градусах Цельсия. Амплитудные графики RT-ddPCR показали чёткое разделение капель для гамма-актина как в целом нейроне, так и в образцах нейрита, что подтверждает надёжное обнаружение транскриптов.

Для Gap43 почти 23% пула мРНК присутствует в нейритах, по сравнению с гамма-актином, где в нейритах содержится только 5% пула мРНК по сравнению со всей долей нейрона. Мы показали наличие структур стрессовых гранул в аксонах при физиологических условиях, которые подавляют локальный синтез белков. Наш протокол предлагает надёжный и последовательный метод изоляции нейронных компартментов и обнаружения мРНК в низкой среде.

Будущий анализ будет сосредоточен на выделении и характеристике отдельных аксональных поддоменов, таких как конусы роста и аксональный ствол, выходящие за рамки объёмного анализа.