Обнаружение экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крыс с использованием количественной ПЦР в реальном времени

Общая цель данной процедуры заключается в успешной очистке и обнаружении мРНК в брюшинной мембране крысы. Для начала процедуры, после ингаляционной анестезии 4% isoflurane, обработайте кожу живота крысы 70% ethanol и зафиксируйте животное на пробковом листе на спине.

Затем с помощью ножниц и пинцета сделайте продольный разрез кожи живота, мышц и брюшины животного. Захватите брюшину пинцетом и сделайте горизонтальные разрезы в её верхней части вдоль нижнего ребра под диафрагмой, а также в её нижней части в латеральной области, используя хирургические ножницы.

Затем с помощью хирургических ножниц сделайте боковые продольные разрезы, чтобы удалить брюшину из полости тела. После этого промойте ее в чашке Петри с использованием PPS. Вырежьте и подготовить образец брюшины массой 20 milligrams.

В данной процедуре поместите образец брюшинной мембраны массой 20 mg в стеклянный гомогенизатор. Добавьте 700 µL лизирующего реагента на основе гуанидина и фенола. После этого гомогенизируйте образец брюшинной мембраны на льду, медленно нажимая пестиком на образец с одновременным вращением.

Повторяйте этот процесс несколько десятков раз, пока образец брюшины полностью не растворится в лизирующем реагенте на основе фенолгуанидина. Для дальнейшей гомогенизации перенесите гомогенизированный лизат в систему измельчения биополимеров в центрифужную микроколонку в пробирке для сбора объемом 2 мл. Затем центрифугируйте образец при 14 000 ×g в течение трех минут при температуре 4 °C.

Затем перенесите гомогенизированный лизат в новую микроцентрифужную пробирку. Добавьте 140 µL хлороформа к гомогенизированному лизату и плотно закройте пробирку крышкой. После этого перемешайте содержимое пробирки путем инверсии в течение 15 секунд.

После этого инкубируйте образец в течение двух-трех минут при комнатной температуре. Затем центрифугируйте его при 12,000 ×g в течение 15 минут при температуре четыре °C. Перенесите 300 µL супернатанта в новую микроцентрифужную пробирку, стараясь не задеть осадок.

Добавьте 450 µL 100% этанола. Затем перемешайте образец с помощью вортекса в течение пяти секунд. Затем перенесите пипеткой до 700 µL образца в спин-колонку с силиконовой мембраной, помещенную в коллекционную пробирку объемом 2 мл, и закройте крышку.

Затем центрифугируйте образец при 15 000 ×g в течение 15 секунд. После центрифугирования удалите фильтрат из пробирки для сбора. Затем добавьте 700 µL промывочного буфера 1 в центрифужную колонку с кремниевой мембраной для тщательной промывки образца и закройте крышку.

Центрифугируйте образец при 15 000 ×g в течение 15 секунд. После центрифугирования удалите фильтрат из пробирки для сбора. Добавьте 500 µL промывочного буфера 2 в спин-колонку на основе силикатной мембраны для удаления остатков солей и закройте крышку.

Затем центрифугируйте образец при 15 000 ×g в течение 15 секунд. После центрифугирования удалите супернатант и пробирку для сбора, затем повторите эту процедуру. Далее снова центрифугируйте спин-колонку с силикатной мембраной при 15 000 ×g в течение одной минуты.

После центрифугирования удалите пробирку для сбора и весь прошедший раствор. Поместите центрифужную колонку с силикатной мембраной в новую пробирку для сбора объемом 1,5 мл. Затем нанесите на колонку 25 µL воды, свободной от РНказ, и закройте крышку.

Выдержите образец при комнатной температуре в течение пяти минут. Центрифугируйте его при 15 000 ×g в течение одной минуты. После этого перенесите 25 µL надосадочной жидкости, содержащей общую РНК, в новую микроцентрифужную пробирку и храните при −80 °C до использования.

В данной процедуре приготовьте раствор мастер-микса, содержащий 2 µL 10-кратного набора для очистки нуклеиновых кислот, 2 µL смеси обратной транскриптазы и 4 µL 5-кратного буфера Hispec, чтобы общий объем составил 8 µL на пробирку. Затем распределите по 8 µL раствора мастер-микса в каждую пробирку. Измерьте количество суммарной РНК с помощью спектрофотометра.

После этого в каждую пробирку добавьте один микрограмм выделенной суммарной РНК, очищенной из образца брюшинной мембраны. Затем добавьте в каждую пробирку воду, свободную от РНКаз, до общего объема 20 микролитров. Тщательно перемешайте содержимое путем пипетирования и центрифугируйте в течение 15 секунд.

После этого инкубируйте образец в течение 60 минут при 37 °C. Затем инкубируйте его в течение пяти минут при 95 °C. Перенесите полученную кДНК в новую микроцентрифужную пробирку и разведите ее в 10 раз водой, не содержащей РНказы.

В данной процедуре для каждой лунки приготовьте мастер-микс, содержащий 12.5 µL 2x PCR master mix, по 2.5 µL 5 µM каждого праймера к miRNA, растворенного в воде, свободной от нуклеаз, и 1.25 µL 10x universal primer. Раздайте по 22.5 µL этого мастер-микса в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем добавьте в каждую лунку 2.5 µL матричной кДНК.

Герметизируйте реакционную планшету на 96 лунок кусочком пленки. Затем центрифугируйте ее при 1 000 ×g в течение 30 секунд. Для запуска программы ПЦР-циклирования поместите планшету в прибор для ПЦР в реальном времени.

В программном обеспечении для ПЦР в реальном времени определите параметры эксперимента. Затем присвойте имена образцам и целевым miRNA в каждой лунке. После этого в программном обеспечении для ПЦР в реальном времени укажите объем реакции 20 µL и следующие условия циклов ПЦР в соответствии с инструкциями.

Предварительная инкубация при 95 °C в течение 15 минут. Затем 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 15 секунд, отжига при 55 °C в течение 30 секунд и элонгации при 70 °C в течение 30 секунд. На основании скрининга микромассивов miRNA с использованием qRT-PCR согласно протоколу, представленному в данной работе, было обнаружено, что уровни шести miRNA значительно повышены в брюшине крыс с перитонеальным фиброзом по сравнению с уровнями в группе имитации и контрольной группе крыс.