Обнаружение экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крыс с использованием количественной ПЦР в реальном времени

Общая цель этой процедуры заключается в успешном очистке и обнаружении микроРНК в перитонеальной мембране крысы. Начинать эту процедуру, после ингаляционной анестезии с 4% изофлураном. Сбрызните брюшную кожу крысы 70% этанолом и закрепите его на пробковом листе, на ее спине.

Далее с помощью ножниц и щипцов сделайте продольный разрез на коже живота, мышцах и перитонеальной оболочке. Возьмите перитонеальную оболочку с помощью щипцов и сделайте горизонтальные разрезы на ее верхней части вдоль нижней реберной кости под диафрагмой. А с нижней его стороны на боковой области с помощью хирургических ножниц.

Далее сделайте боковые продольные разрезы для удаления перитонеальной оболочки из тела, с помощью хирургических ножниц. Затем вымойте его с PPS в чашке Петри. Вырежьте и обрежьте 20 миллиграммов образца брюшинной мембраны.

Во время этой процедуры образец перитонеальной мембраны массой 20 мг помещается в стеклянный гомогенизатор. И добавить 700 микролитров лизисного реагента на основе фенолагуанидина. После этого гомогенизируйте образец перитонеальной мембраны на льду, замедляя надавливание пестика на образец с закручиванием.

Повторите этот процесс несколько десятков раз, пока образец перитонеальной мембраны полностью не растворится в реагенте для лизиса на основе фенолагуанидина. Для дальнейшей гомогенизации перенесите гомогенизированный лизат в систему измельчения биополимеров в спиновой колонке микроцентрифуги в двухмиллилитровой сборной пробирке. Затем центрифугируйте его при температуре 14 000 раз G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.

Затем перенесите гомогенизированный лизат в новую микроцентрифужную пробирку. Добавьте 140 микролитров хлороформа к гомогенизированному лизату и надежно закройте пробирку. Впоследствии перемешиваем пробирку методом инверсии в течение 15 секунд.

После этого инкубируйте образец в течение двух-трех минут при комнатной температуре. После этого центрифугируйте его при температуре 12 000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите 300 микролитров надосадочной жидкости в новую микроцентрифужную пробирку, не нарушая осадок.

И добавляем 450 микролитров 100% этанола. Затем перемешайте образец, вортексируя в течение пяти секунд. Далее пипеткой вливают до 700 микролитров образца в спиновую колонку на основе силиконовой мембраны, помещенную в двухмиллилитровую пробирку для сбора, и закрывают колпачк.

Затем центрифугируйте его при 15 000 G в течение 15 секунд. После центрифугирования слейте поток через сборную трубку. Затем добавьте 700 микролитров промывочного буфера 1, в спиновую колонку на основе силиконовой мембраны для строгой промывки образца и закройте крышку.

Центрифугируйте его при 15 000 умноженных на G в течение 15 секунд. После центрифугирования слейте поток через сборную трубку. Добавьте 500 микролитров промывочного буфера 2 в отжимную колонку на основе силикатной мембраны, чтобы удалить любые следы соли, и закройте крышку.

Затем центрифугируйте его при 15 000 G в течение 15 секунд. После центрифугирования отбросьте сквозной и сборный пробирки и повторите эту процедуру снова. Затем снова центрифугируйте спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны при перегрузке в 15 000 раз G в течение одной минуты.

После центрифугирования выбросьте сборную трубку и любой поток через нее. Поместите спиновую колонку на основе силикатной мембраны в новую пробирку для сбора объемом пять целых пять миллилитров. Затем перелейте 25 микролитров воды, свободной от РНКазы, на колонку и закройте крышку.

Оставьте образец при комнатной температуре на пять минут. Центрифугируйте его при 15 000 умноженных на G в течение одной минуты. После этого перенесите 25 микролитров алуэта, содержащего общую РНК, в новую микроцентрифужную пробирку и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия перед использованием.

В этой процедуре приготовьте исходный раствор смеси, который содержит два микролитра 10-кратной смеси нуклеиновых кислот, два микролитра смеси обратной транскриптазы и четыре микролитра 5-кратного буфера Hispec, что в сумме составляет 8 микролитров на пробирку. Затем дозируйте по 8 микролитров раствора мастер-смеси в каждую пробирку. Измерьте количество общих РНК с помощью спектрофотометра.

После этого добавьте в каждую пробирку по одному микрограмму выделенных общих РНК, выделенных из образца перитонеальной мембраны. После этого добавьте воду, не содержащую РНКазы, в каждую пробирку, чтобы довести ее до 20 микролитров. Затем тщательно перемешайте его с помощью пипетирования и центрифугируйте в течение 15 секунд.

После этого инкубируйте образец в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем выдержите его в течение пяти минут при температуре 95 градусов по Цельсию. Перенесите вновь сгенерированную кДНК в новую микроцентрифужную пробирку и разбавьте ее в 10 раз водой, не содержащей РНКазы.

В этой процедуре приготовьте мастер-смесь, содержащую 12 целых пять микролитров 2x мастер-смеси для ПЦР, две целые пять десятых микролитров каждого праймера микроРНК, растворенного в воде, свободной от нуклеазы, и одну целую две целых пять микролитров 10x универсального праймера, для каждой лунки. Раздайте 22 целых пять микролитров этой мастер-смеси в каждую лунку 96-луночной пластины. Затем добавьте в каждую лунку по две целых пять десятых микролитров матричной кДНК.

Запечатайте 96 лунку реакционной пластины куском пленки. Затем центрифугируйте его при 1000 G в течение 30 секунд. Чтобы запустить циклическую программу ПЦР, установите планшет в прибор для ПЦР в реальном времени.

В программном обеспечении для ПЦР в реальном времени определите экспериментальные свойства. Затем присвойте образцы имена и целевые микроРНК в каждой лунке. Затем в программное обеспечение для ПЦР в режиме реального времени вводят реакционный объем 20 микролитров и следующие условия цикличности ПЦР в соответствии с инструкцией.

Предварительная инкубация при температуре 95 градусов Цельсия в течение 15 минут. А затем 40 циклов денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 15 секунд, и стояние на коленях при 55 градусах Цельсия в течение 30 секунд, и разгибание при 70 градусах Цельсия в течение 30 секунд. На основе скрининга микроРНК было обнаружено, что уровни шести микроРНК значительно повышены в перитонеальной мембране крыс с перитонеальным фиброзом, по сравнению с таковыми у фиктивных крыс и контрольных крыс, с использованием QRTCPR в соответствии с протоколом, представленным в этой рукописи.