Trypsinizing и субкультивирования клетках млекопитающих

Технология культивирования тканей нашла широкое применение в области клеточной биологии. Тем не менее, культивируемые клетки требуют регулярного ухода, чтобы оставаться здоровыми. По мере того, как клетки достигают беглости, они должны быть субкультивированы или пассированы.

Невыполнение этого требования приводит к замедлению роста и, в конечном итоге, к гибели клеток. В этом видео мы демонстрируем, как поддерживать клетки тканевой культуры как для адгезивных, так и для суспензионных клеточных линий. Привет, я Рики здесь, в лаборатории доктора Лана в сети лабораторий молекулярной патологии в Восточном Теннесси.

Сегодня я хочу показать вам две техники упаковки суспензии и адгезивных клеток. К прохождению проходит пластина с клетками. Мы хотим начать с первичной культуры, выращенной до такой же беглости в 60-миллиметровой чашке Петри или в 25-сантиметровой квадратной колбе для культуры тканей, содержащей пять мил среды для культуры тканей.

Мы начинаем с удаления всей среды из первичной культуры с помощью стерильной пипетки. Затем один или два раза промываем прилипший монослой ячейки небольшим объемом 37 градусов Цельсия HBSS без кальция и магния. Удалить любые остатки фетальной бычьей сыворотки, которые могут ингибировать действие фермента трипсина, который будет добавлен на следующем этапе.

Далее добавьте в культуру достаточно теплый раствор трипсина ЭДТА так, чтобы вы покрыли адгезивный слой клеток. Затем вы можете поставить тарелку на поднос для подогрева при температуре 37 градусов Цельсия на одну-две минуты. После инкубации постучите по нижней части пластины по ровной поверхности, чтобы выбить ячейки.

Проверьте культуру с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что клетки округлены в большую сторону, что указывает на то, что они оторваны от поверхности. Если ячейки недостаточно отделены, верните тарелку в поддон для подогрева еще на минуту или две. Посмотрев в эндоскоп, промойте чашку в полной среде и пипетируйте суспензию в коническую трубку диаметром 15 мил, содержащую два мила полной среды.

Раскрутите ячейки, чтобы гранулировать их, и снова суспендируйте гранулу в готовой среде. Теперь добавьте равное количество клеточной суспензии на каждую из свежих пластин, которые были соответствующим образом помечены. В качестве альтернативы, клетки могут быть подсчитаны с помощью гемоцитометра и разбавлены до желаемой плотности, чтобы можно было добавить определенное количество клеток к каждой пластине.

Обязательно пометьте каждую табличку датой субкультуры и проходным номером. После добавления клеточной суспензии вносите по одному милю свежей среды в каждую новую культуру. Теперь инкубируйте планшеты во влажном инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия.

После того, как вы инкубируете клетки в течение ночи, добавьте в пластины свежую среду и установите их обратно при температуре 37 градусов. Как только пластина станет плавной, вы можете снова пропустить пластину, повторив эту процедуру, и продолжить прохождение по мере необходимости. Теперь мы покажем вам, как проходить клетки в суспензионной культуре.

Упаковка клеток в суспензионную культуру проще, чем в адгезивные клетки. Перед упаковкой суспензионных культур клетки необходимо поддерживать путем кормления каждые два-три дня до тех пор, пока они не достигнут кобеглости, когда клетки слипаются в суспензии, и среда становится турной. Когда колба закручивается.

Для этого выньте колбу с суспензионными ячейками из инкубатора, стараясь не потревожить те, которые осели в колбе. Асептически дно, извлеките и выбросьте примерно одну треть среды из колбы и замените ее равным объемом предварительно подогретой среды при температуре 37 градусов Цельсия. После смены среды поверните колбу и верните ее в инкубатор, где температура составляет 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Если в колбе меньше 15 милов, среду инкубируют в колбе в горизонтальном положении, чтобы усилить контакт между клетками. В противном случае колба может инкубироваться вертикально в те дни, когда культуры не скармливаются. Проверьте их, вращая плоскости, чтобы снова подвесить клетки.

Обязательно наблюдайте за любыми изменениями цвета в среде, которые свидетельствуют о хорошем метаболическом росте. После того, как культуры слились, а их должно быть около 2,5 миллионов клеток на мил, можно их пропускать. И снова мы показали вам, как проводить культивируемые клетки как для адгезивных, так и для суспензионных культур.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи во всех ваших экспериментах.