Name: Trypsinizing и субкультивирования клетках млекопитающих (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-12T13:28:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Узнайте методы трипсинизации и субкультивирования клеток млекопитающих для поддержания жизнеспособности культур. Этот визуальный гид демонстрирует техники работы с адгезионными и суспензионными линиями клеток.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Полный текст протокола для этого экспериментальный подход доступен в <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">Текущий протоколов в клеточной биологии</a> .

Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.

trypsinizing и субкультивирования клетках млекопитающих

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Как клетки достигают слияния, они должны быть субкультивировали или пассировать. Невыполнение субкультуры сливной клеток приводит к снижению митотического индекса и в конечном итоге к гибели клеток. Первый шаг в субкультивирования является отделить клетки с поверхности первичного сосуда культуры трипсинизации или механическими средствами. Полученную суспензию ячейка затем разделить, или reseeded, на свежий культур. Вторичные культуры проверяются на рост и кормить периодически и может быть впоследствии субкультивировали производить третичные культур. Время между пассирования клеток меняется в зависимости от клеточной линии и зависит от скорости роста.

Как клетки достигают слияния, они должны быть субкультивировали или пассировать. Это видео покажет процедуру субкультивирования как сторонник и подвески клеток.

Trypsinizing и субкультивирования клетках млекопитающих

По достижении клетками состояния конфлюэнтности их необходимо подвергнуть субкультивированию или пассажированию. Отсутствие субкультивирования конфлюэнтных клеток приводит к снижению митотического индекса и, в конечном итоге, к...

Технология культивирования тканей нашла широкое применение в области клеточной биологии. Однако для поддержания жизнеспособности культивируемые клетки требуют регулярного ухода. По достижении клетками конфлюэнтности их необходимо подвергнуть субкультивированию или пассажированию.Несоблюдение этого требования приводит к замедлению роста и, в конечном итоге, к гибели клеток. В данном видео мы демонстрируем способы поддержания культур тканей как для адгезивных, так и для суспензионных клеточных линий. Здравствуйте, меня зовут Рики, я нахожусь в лаборатории доктора LAN в сети лабораторий молекулярной патологии в Восточном Теннесси.Сегодня я хочу продемонстрировать вам две методики пассирования суспензионных и адгезивных клеток. Для пассирования клеток из планшета нам понадобится первичная культура, выращенная до полной конфлюэнтности в чашке Петри диаметром 60 мм или в флаконе для культивирования тканей объемом 25 см², содержащем 5 мл среды для культивирования тканей.Сначала с помощью стерильной пипетки удаляют всю среду из первичной культуры. Затем прилипший монослой клеток один или два раза промывают небольшим объемом HBSS без кальция и магния при температуре 37 °C. Это необходимо для удаления остатков фетальной бычьей сыворотки, которая может ингибировать действие фермента трипсина, добавляемого на следующем этапе.Затем добавьте в культуру достаточное количество подогретого раствора трипсина-ЭДТА, чтобы полностью покрыть слой адгезивных клеток. После этого поместите планшет на нагревательный столик при температуре 37 °C на одну-две минуты. По завершении инкубации аккуратно постучите по дну планшета о плоскую поверхность, чтобы открепить клетки.Проверьте культуру с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что клетки округлились, что указывает на их открепление от поверхности. Если клетки открепились недостаточно, верните планшет в термостат еще на одну или две минуты. После осмотра под микроскопом промойте чашку полной средой и перенесите суспензию пипеткой в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл полной среды.Центрифугируйте клетки для получения осадка, затем ресуспендируйте осадок в полной среде. Теперь добавьте равный объем клеточной суспензии в каждую из новых соответствующим образом промаркированных планшетов. В качестве альтернативы клетки можно подсчитать с помощью гемоцитометра и развести до нужной плотности, чтобы в каждый планшет было добавлено определенное количество клеток.Обязательно пометьте каждую чашку датой пересева и номером пассажа. После добавления клеточной суспензии добавьте по 1 мл свежей среды в каждую новую культуру. Затем инкубируйте чашки в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.После инкубации клеток в течение ночи добавьте в планшеты свежую среду и верните их в инкубатор при 37 °C. Когда клетки достигнут состояния слияния (конфлюэнтности), вы можете снова провести пассаж, повторив эту процедуру, и продолжать пассировать клетки по мере необходимости. Теперь мы покажем вам, как проводить пассаж клеток в суспензионной культуре.Пассирование клеток, находящихся в суспензионной культуре, проще, чем для адгезивных клеток. Перед пассированием суспензионных культур клетки необходимо поддерживать, добавляя свежую питательную среду каждые два-три дня, до достижения конфлюэнтности — состояния, при котором клетки в суспензии слипаются в агрегаты, а среда при перемешивании колбы становится мутной.Для этого извлеките колбу с суспензией клеток из инкубатора, стараясь не потревожить клетки, осевшие на дно колбы. В асептических условиях удалите и утилизируйте примерно одну треть среды из колбы и замените ее равным объемом предварительно нагретой до 37 °C среды. После замены среды осторожно перемешайте содержимое колбы круговыми движениями и верните ее в инкубатор с параметрами 37 °C и 5% CO2.Если в колбе содержится менее 15 мл среды, инкубируйте её в горизонтальном положении для улучшения контакта клеток со средой. В противном случае в дни, когда подкормка культур не проводится, колбу можно инкубировать вертикально. Проверяйте состояние культур, аккуратно перемешивая содержимое колб круговыми движениями для ресуспендирования клеток.Обязательно следите за любыми изменениями цвета среды, которые указывают на активный метаболический рост. После того как культуры достигнут конфлюэнтности, что соответствует примерно 2,5 million cells per mil, их можно пересевать. Таким образом, мы продемонстрировали способ пересева культивируемых клеток как для адгезивных, так и для суспензионных культур.На этом всё. Спасибо за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.

trypsinizing-and-subculturing-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Микро-расчлененный эксплантов техника прочный и надежный метод выделения пролиферативной скелетные мышечные клетки от молодых, взрослых и эмбриональных мышц в качестве источника стволовых клеток скелетной мускулатуры. Уникально, эти клетки были клонально производных для производства скелетных мышц линий стволовых клеток для трансплантации в естественных условиях.

Взрослые и эмбриональные скелетных мышц Microexplant культуры и выделение скелетных мышц стволовых клеток

В этом докладе, мы демонстрируем системы, чтобы изолировать и культуры донорских клеток от мышей молочной железы, и orthotopically трансплантации этих клеток мышам-получателей, чтобы проанализировать стромальных: эпителиальных взаимодействий в молочных развития опухоли.

Молочные трансплантации стромальных клеток и клетки карциномы у мышей C57BL/6J

Это видео демонстрирует метод изучения локализации in vivo опухолеспецифических антител в модели ксенотрансплантата опухоли мыши. При подкожном введении раковых клеток мышам для образования опухоли вводятся флуоресцентно меченные антитела, которые связываются с опухолево-специфическими рецепторами, что позволяет in vivo оценить локализацию антител с помощью визуализации.

Методика оценки локализации опухолеспецифических антител in vivo

Видео демонстрирует анализ для оценки активности массового аутофагического секвестрации в клетках млекопитающих. Он использует электропорацию для высвобождения цитозольных белков, включая лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Секвестрированные фракции ЛДГ и суммарные клеточные фракции ЛДГ определяются для оценки секвестрации ЛДГ, что дает представление об общей активности объемной секвестрации.

Количественная оценка активности объемной аутофагической секвестрации в клетках млекопитающих

Это видео демонстрирует протокол выделения и культивирования первичных клеток коры головного мозга из дорсолатерального конечного мозга эмбрионов мышей.

Выделение и культивирование клеток дорсолатерального конечного мозга эмбриона мыши

Этот метод предоставляет метод для сбора, нормализации и количественного роста внутриклеточных бактериальных патогенов, которые предварительно выращивают в естественных клеток-хозяев простейших до инфекциями клеток млекопитающих. Этот метод может быть модифицирован, чтобы приспособить широкий спектр клеток-хозяев для грунтования этапе, а также типы клетки-мишени.

Послушный млекопитающих инфекции сотовый с Протозойные грунтовка бактерии

Мы описываем процедуры для маркировки и генотипирования новорожденных мышей и генерации первичных нейронов культур от них. Генотипирование является быстрым, эффективным и надежным, и позволяет для автоматического нуклеиновых кислот добычи. Это особенно полезно для неонатально летальных мышей и их культур, которые требуют предварительного завершения генотипирования.

Быстрое Генотипирование животных Круги путем создания первичных культурах мозга нейронов

Целью этого протокола является изоляция эпидермальных кератиноцитов из псовой кожи взрослых мышей для различных приложений вниз по течению, таких как молекулярная биология, биохимия, флуоресценция активированной сортировки клеток, и первичных в пробирке использует (например, клоногенные приложения кератиноциты).

Изоляция мыши Эпидермальных кератиноцитов и их в пробирке клоногенной культуры

Представлена методика быстрой стабилизации поступательных (белковый биосинтез) комплексов со сшиванием формальдегида в живых дрожжевых и млекопитающих клетках. Этот подход позволяет препарировать переходные промежуточные продукты и динамические взаимодействия РНК:белок. Сшитые комплексы могут использоваться в нескольких последующих приложениях, таких как методы профилирования на основе глубокого секвенирования, микроскопия и масс-спектрометрия.

Быстрая фиксация in vivo и выделение трансляционных комплексов из эукариотических клеток

Биотинилирование с ограниченным местоположением AviTag (ALIBi) — это новый оптогенетически активированный метод, разработанный для маркировки и очистки субклеточных популяций рибосом с целью дальнейшего секвенирования и протеомного анализа.

Выделение субклеточных субпопуляций рибосом на основе биотинилирования, специфичного для рекомбинантных пептидных меток, ограниченного расположением и освещения

Узнайте методы трипсинизации и субкультивирования клеток млекопитающих для поддержания жизнеспособности культур. Этот визуальный гид демонстрирует техники работы с адгезионными и суспензионными линиями клеток.

Trypsinizing и субкультивирования клетках млекопитающих

Больше видео