DNA-isolatie

DNA uit cellen is nodig voor veel biotechnologie- en onderzoekstoepassingen, zoals moleculair klonen. Om DNA uit cellen te verwijderen en te zuiveren, gebruiken onderzoekers verschillende DNA-extractie methoden. Hoewel de specifieke kenmerken van verschillende protocollen kunnen variëren, liggen enkele algemene concepten ten grondslag aan het proces van DNA-extractie.

Het proces

Ten eerste moeten cellen worden gelyseerd – opengebroken – om het DNA in oplossing te laten komen. Cellen kunnen fysiek worden gelyseerd met behulp van apparatuur zoals een homogenisator, ultrasoonapparaat of parelklopper, die kracht uitoefenen om de cellen open te breken. Vaak worden tijdens de lyse stoffen zoals detergentia toegevoegd om de celmembranen op lipidenbasis chemisch te verstoren, waardoor het DNA uit de kern en cel vrijkomt. Door het ronddraaien in een centrifuge slaat het celafval neer op de bodem, en het lysaat – dat cellulaire materialen bevat – wordt verzameld voor verdere verwerking.

Het DNA moet dan worden gescheiden van andere cellulaire moleculen, zoals RNA en eiwitten. Daarom worden enzymen zoals RNase en Proteinase K vaak toegevoegd tijdens of na lyse om respectievelijk RNA en eiwitten af te breken. Bovendien worden organische oplosmiddelen zoals fenol en chloroform vaak gebruikt om DNA van eiwit te scheiden. Het monster wordt vaak gemixt met fenol-chloroform en vervolgens gecentrifugeerd om de waterige en organische stoffen in de buis te scheiden. De DNA-bevattende waterige gedeelte bovenaan kan dan worden afgepipetteerd, waarbij het eiwit in het organische gedeelte achterblijft.

Zouten worden vaak toegevoegd tijdens DNA-extractie om het DNA te stabiliseren en DNA te laten neerslaan. Een standaardmethode voor DNA-precipitatie is om ijskoude alcohol, zoals ethanol of isopropanol, aan het monster toe te voegen. Hierdoor vormt het DNA een witte, troebele neerslag in de vloeistof in de buis.

Het monster wordt vervolgens in een centrifuge rondgedraaid, waardoor het DNA-neerslag zich op de bodem van de buis verzamelt. De neerslag wordt gewassen door de vloeistof te verwijderen, te wassen in alcohol, en opnieuw te centrifugeren. Na de laatste wasbeurt wordt de neerslag opnieuw gesuspendeerd in een buffer, waardoor een waterige oplossing van gezuiverd DNA ontstaat die klaar is om te worden bestudeerd of gebruikt in de biotechnologie.