Back to chapter

15.9:

عزل الحمض النووي DNA

JoVE Core
Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Core Biology
DNA Isolation

Languages

Share

استخراج الحمض النووي هو الإزالة وتنقية الحمض النووي من الخلايا. الخلايا الأولى هي lysed كسر مفتوحة. عادة من خلال مجموعة من الاضطرابات الجسدية والعلاج بالمواد الكيميائية مثل المنظفات الذي يذوب الخلية والأغشية النووية.المحتوى يمكن أن تطفو بحرية في الحل المحيط. يجب فصل الحمض النووي التالي عن الجزيئات الأخرى الموجودة. المذيبات العضوية مثل الفينول والكلوروفورم يشيع استخدامها لفصل الأحماض النووية عن البروتينات بناء على اختلاف ذوبانهم.بالإضافة إلى ذلك إنزيمات البروتيناز و RNase يمكن استخدامها لتحطيم البروتينات والحمض النووي الريبي ترك الحمض النووي سليمة. يضاف الملح عادة إلى العينة الذي يستقر مجموعات الفوسفات سالبة الشحنة في العمود الفقري للحمض النووي. وبعد إضافة الجليد البارد الكحول يترسب الحمض النووي خارج الحل.يتم جمع الراسب الأبيض من خلال الغزل في أجهزة الطرد المركزي حيث يستقر في أسفل الأنبوب. بعد الغسيل وإعادة تعليقه في محلول مؤقت يمكن أخيرًا استخدام الحمض النووي المستخرج في البحث أو تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

15.9:

عزل الحمض النووي DNA

الحمض النووي مطلوب من الخلايا للعديد من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية والبحث ، مثل الاستنساخ الجزيئي. لإزالة وتنقية الحمض النووي من الخلايا ، يستخدم الباحثون طرقاً مختلفة لاستخراج الحمض النووي. في حين أن تفاصيل البروتوكولات المختلفة قد تتنوع ، فإن بعض المفاهيم العامة تكمن وراء عملية استخلاص الحمض النووي.

العملية

أولاً ، تحتاج الخلايا إلى أن تُحل _ كسر مفتوح _ لتحرير الحمض النووي في المحلول. يمكن أن تُحل الخلايا فيزيائياً باستخدام معدات مثل المجانس ، أو جهاز الصوت ، أو الخافق بالخرز ، والذي يطحن أو يستخدم القوة لكسر الخلايا لفتحها. في كثير من الأحيان ، يتم إضافة مواد مثل المنظفات أثناء التحلل لتعطيل أغشية الخلايا الدهنية كيميائياً ؛ مما يساعد على إطلاق الحمض النووي من النواة والخلية. الدوران في جهاز الطرد المركزي يرسب حطام الخلية إلى أسفل ، ويتم جمع المحللة _ المحتوية على مواد خلوية _ لمزيد من المعالجة.

يجب بعد ذلك فصل الحمض النووي عن الجزيئات الخلوية الأخرى ، مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات. لذلك ، غالباً ما تتم إضافة إنزيمات مثل RNase و بروتينيز K أثناء التحلل أو بعده لتحطيم الحمض النووي الريبي والبروتينات ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم المذيبات العضوية مثل الفينول والكلوروفورم بشكل شائع لفصل الحمض النووي عن البروتين. عادةً ما يتم تدوير العينة باستخدام الفينول_كلوروفورم ثم طردها بالطرد المركزي لفصل الأجزاء المائية والعضوية في الأنبوب. يمكن بعد ذلك إزالة الجزء المائي المحتوي على الحمض النووي في الجزء العلوي ، تاركاً البروتين في الجزء العضوي.

غالباً ما تُضاف الأملاح أثناء استخلاص الحمض النووي لتثبيت الحمض النووي والمساعدة في إخراجه من المحلول. تتمثل الطريقة القياسية لترسيب الحمض النووي في إضافة كحول مثلج مثل الإيثانول أو الأيزوبروبانول إلى العينة. يؤدي هذا إلى تكوين الحمض النووي لترسبات بيضاء ضبابية داخل السائل في الأنبوب.

تُدار العينة بعد ذلك في جهاز طرد مركزي ، مما يتسبب في تراكم الحمض النووي في قاع الأنبوب على شكل حبيبات. يتم غسل الحبيبات بإزالة السائل ، والغسيل بالكحول ، وتدويره مرة أخرى. بعد الغسل النهائي ، يتم إعادة تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت _ مما يخلق محلولاً مائياً من الحمض النووي المنقى جاهزاً للدراسة أو الاستخدام في التكنولوجيا الحيوية.