Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte I: a digestão e coleta de tecido pancreático), utilizando um método modificado automatizado.
Gestão da diabetes tipo 1 é onerosa, tanto para o indivíduo ea sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de monitoramento de glicose e insulina novas formulações, muitas pessoas ainda desenvolvem devastadoras complicações secundárias. Transplante de ilhotas pancreáticas pode restaurar controle quase normais de glicose em pacientes diabéticos<sup> 1</sup>, Sem o risco de graves episódios de hipoglicemia que estão associados com a terapia insulínica intensiva. Fornecimento de massa de ilhotas suficiente é importante para o transplante de ilhotas bem sucedido. No entanto, características dos doadores, a colheita de órgãos e preservação afetar o resultado de isolamento<sup> 2</sup>. Na Universidade de Illinois em Chicago (UIC), temos desenvolvido um protocolo de isolamento bem sucedido com um gradiente de purificação melhorou<sup> 3</sup>. O programa foi iniciado em janeiro de 2004, e mais de 300 isolamentos foram realizados até novembro de 2008. O pancreata foram enviados em soluções frias de conservação (UW, University of Wisconsin ou HTK, histidina-triptofano Ketoglutarate)<sup> 07/04</sup> Para o Laboratório de Isolamento Celular na UIC para isolamento de ilhotas. Ilhotas pancreáticas foram isolados utilizando o método de UIC, que é uma versão modificada do método originalmente descrito por Ricordi<em> Et al</em><sup> 8</sup>. Resumidamente, após a limpeza do pâncreas do tecido circundante, foi perfundido com solução enzimática (Serva Colagenase + Neutro Protease ou enzima Sigma V). O pâncreas distendido foi então transferido para a câmara de digestão Ricordi, conectado a um sistema modificado de tubulação, fechada a circulação, e aquecido a 37 ° C. Durante a digestão, a câmara foi agitada suavemente. As amostras foram tomadas de forma contínua para monitorar o progresso digestão. Uma vez livre ilhotas foram detectadas ao microscópio, a digestão foi parado por lavagem a frio (4 ° C) RPMI solução de diluição (Mediatech, Herndon, VA) para o sistema de circulação para diluir a enzima. Depois de ser coletados e lavados em M199 meio suplementado com albumina humana, o tecido foi amostrado para a purificação de pré-contagem e incubadas com solução de UW antes de purificação. Processo de purificação serão descritos na Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos.
Há uma variedade de fatores que afetam o resultado de isolamento 9,10. Entre eles, a digestão do tecido pancreático desempenha um papel proeminente. Baseado em nossa experiência humana de isolamento de ilhotas própria, resumimos seguintes pontos críticos, o que poderia influenciar o rendimento de ilhotas e qualidade.
Apoiada por um financiamento da Universidade de Illinois em Chicago, assim como Cell Resource Islet Centro NIH subvenção (RFA-RR 05-003), a Fundação Christopher, a Fundação Efroymson, ea Fundação Tellabs.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Metler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole Parmer Instrument Co | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
Perfusion Unit | equipment | Custom Made/Swiss | n/a | |
Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
RPMI dilution solution | reagent | Mediatech Inc | 99783024 | |
University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |