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Biology

Murin procédure transplantation rénale

doi: 10.3791/1150 Published: July 10, 2009

Summary

La transplantation rénale chez les souris est une procédure techniquement difficile qui exige attention soins post-opératoires et le traitement de la réussite.

Abstract

La transplantation rénale orthotopique chez la souris est une procédure difficile techniquement. Bien que les premières transplantations de reins chez des souris ont été effectuées par Russell et al il ya 30 ans (1) et affiné par Zhang et al ans plus tard (2), peu de gens dans le monde ont maîtrisé cette procédure. Dans notre laboratoire, nous avons réalisé avec succès 1200 transplantations rénales orthotopique avec un taux> 90% de survie. Les points clés de la réussite incluent un contrôle rigoureux des lésions de reperfusion, des saignements et des thromboses, tant durant la procédure et post-transplantation, et l'utilisation de 10-0 au lieu de 11-0 de suture pour anastomoses.

Soins post-opératoires et le traitement du destinataire est extrêmement important pour le succès de greffe et d'évaluation. Tous les bénéficiaires du greffon rénal recevoir des antibiotiques sous la forme d'une injection de pénicilline immédiatement post-transplantation et Sulfatrim dans l'eau potable en permanence. La santé animale global est évalué quotidiennement et toute analyse de la créatinine sanguine sont effectuées régulièrement avec un portable i-STAT machine pour évaluer la fonction du greffon.

Protocol

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Récolte des donneurs d'organes (2):

  1. Anesthésier le donneur à l'aide de pentobarbital 65mg/kg IP; anesthésie est maintenue par l'isoflurane (2-3%).
  2. Faire une incision médiane du sternum au pubis pour entrer dans le ventre des bailleurs de fonds et d'exposer le rein gauche en déplaçant latéralement l'intestin vers le côté droit.
  3. Isoler le rein gauche par ligature des vaisseaux, et en divisant surrénales et des testicules avec une suture 8-0 soie.
  4. Mobiliser l'aorte au-dessus de sa jonction avec l'artère et la veine rénales.
  5. Mobiliser la veine cave inférieure (VCI) ci-dessus et en dessous de sa jonction avec l'artère et la veine rénales.
  6. Ligaturer l'aorte dessous de l'artère rénale et la veine avec une suture de soie 8-0 à minimiser les saignements.
  7. Disséquer l'uretère gauche du hile rénal à la vessie.
  8. Exposer la jonction urétéro-vésicale en utilisant la rétraction caudale sur le dôme de la vessie.
  9. Accise un petit correctif elliptique de la vessie contenant la jonction urétérovésicale gauche, utilisé pour la reconstruction urinaires par une anastomose vésico-à-vessie. L'uretère droit n'est pas incluse avec la vessie.
  10. Ligaturer les IVC dessous de l'artère rénale et la veine avec une suture 8-0 soie.
  11. Ligaturer l'aorte au-dessus de l'artère rénale et la veine, et lentement perfuser la greffe in situ avec 0.2-0.4ml froid, hépariné solution de Ringer lactate via l'aorte.
  12. Ligaturer la veine cave inférieure au-dessus de l'artère rénale et la veine avec une suture 8-0 soie.
  13. Transect la veine rénale à sa jonction avec la VCI.
  14. Diviser l'aorte en oblique, à environ 2mm dessous de l'artère rénale.
  15. Retirez le rein et sa vascularisation avec l'uretère attaché à la vessie le patch en bloc. Stocker dans une solution de lactate de Ringer sur la glace.
  16. Euthanasier la souris donneuse par dislocation cervicale sous anesthésie.

Récipiendaire Transplantation (2):

  1. Anesthésier le destinataire avec 65 mg / kg de pentobarbital ip et maintenir l'anesthésie par isoflurane (2-3%).
  2. Faire une incision médiane, la couverture de l'intestin avec de la gaze humide et soigneusement rétractent vers le côté gauche.
  3. Ligaturer l'uretère droit, l'artère rénale et la veine, et retirer le rein droit.
  4. Soigneusement isoler et de clampage de l'aorte sous-rénale et IVC avec deux pinces de 4 mm, après ligature microvasular les branches lombaires.
  5. Placer une suture nylon 10-0 grâce à une épaisseur totale de l'aorte et se rétractent pour faire une aortaotomy elliptique en une seule coupe (environ un cinquième du diamètre du vaisseau).
  6. Faites une venotomy longitudinale en perçant la VCI avec une aiguille de calibre 30 et d'étendre de façon appropriée en utilisant microciseaux.
  7. Rincer la fois l'aorte et IVC avec une solution saline héparinée pour effacer le sang ou des caillots intraluminale.
  8. Retirez le rein d'un donneur de la glace et la placer intra-abdominale dans le flanc droit de la souris. Le rein d'un donneur est maintenu humide avec un tampon de gaze imbibé de sérum physiologique froid.
  9. Placer deux points de suture séjour à l'apex proximales et distales de l'aortaotomy destinataires avec le brassard aortique donateurs.
  10. Faire une anastomose de bout-en-côte entre le brassard aortique donateurs et la paroi antérieure de l'aortaotomy destinataires, en utilisant 2 ~ 3 continue 10-0 sutures en nylon à l'extérieur de l'aorte.
  11. Tournez la greffe rein d'un donneur sur le flanc gauche de la destinataire. répétez la procédure précédente entre le brassard aortique donateurs et la paroi postérieure de l'aortaotomy destinataires
  12. Effectuer une anastomose de bout-en-latérale entre la veine rénale donateurs et la paroi postérieure de la VCI destinataires, à l'aide de 4 à 5 points de suture en nylon 10-0 continue à l'intérieur de la VCI. puis la paroi antérieure de la veine rénale IVC et les bailleurs de fonds sont fermées avec 4 ~ 5 points de suture continue en dehors de la VCI.
  13. L'anastomose des deux veines et l'artère doit être terminée dans les 20 minutes.
  14. Rincer la greffe avec une solution saline froide à plusieurs reprises pendant l'anastomose.
  15. Diviser le dôme de la vessie bénéficiaire, et arrêter le saignement avec cautérisation.
  16. Faire une petite entaille sur le dôme.
  17. Placer deux points de suture séjour de nylon 10-0 à anastomize le patch donateurs petite vessie avec le dôme vésical destinataires. Chaque côté de l'anastomose est suturée avec 8 ~ 10 points de suture continue.
  18. Fermer l'abdomen en deux couches avec des continues 4-0 stérile, suture synthétique absorbable vicryl.
  19. Donnez souris receveuses 0.4ml eau chaude salée pendant la chirurgie par injection intraveineuse intermittente.

Soins post-opératoires du bénéficiaire

  1. Après la fermeture de l'abdomen, une seule injection intramusculaire de pénicilline (500U/10g) est administré (2).
  2. En outre, les bénéficiaires reçoivent 0,05 mg / kg par voie intramusculaire buprénorphine au jour 0 et après la chirurgie le jour 1 pour la douleur. Après la chirurgie, les receveurs de greffe de recevoir de l'eau contenant Sulfatrim (100mg/kg) jusqu'à ce que l'expérience est TErminated.
  3. Pour les premières 24h après l'intervention des souris sont conservés dans un incubateur à température contrôlée.
  4. Souris généralement récupérer de l'anesthésie à 1 heure de l'opération et reçoivent de la nourriture régulière et eau ad libitum.
  5. Sutures de la peau sont retirés 2 semaines après la chirurgie.

Récipiendaire néphrectomie

  1. Anesthésier le destinataire 4 ~ 7 jours après la transplantation rénale avec 65 mg / kg de pentobarbital ip; anesthésie est maintenue par l'isoflurane (2-3%).
  2. Ouvrez l'abdomen par une incision médiane.
  3. Couverture de l'intestin avec une solution saline gaze imbibée et soigneusement se rétracter sur le côté droit.
  4. Retirez le rein gauche, après ligature de la veine rénale uretère gauche, et l'artère.
  5. Fermer l'abdomen en deux couches avec des continues 4-0 suture synthétique absorbable vicryl.

Whole Mesures créatinine sanguine

  1. Hebdomadaire à la collecte de sang toutes les deux semaines de moins de 0,2 cc est réalisée soit submandibularly sans anesthésie ou rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane.
  2. Quantitative l'ensemble des taux de créatinine sanguine sont déterminés en utilisant un analyseur portatif I-Stat clinique (Heska Corp, Fort Collins, CO).
  3. Unités conventionnelles (mg / dl) sont convertis en unités SI de micromol / L en multipliant les unités conventionnelles de 88,4.

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Discussion

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Nous avons effectué environ 1200 cas de transplantation rénale chez les souris avec un taux de succès technique de> 90%. Comparé à une transplantation cardiaque, le taux de réussite de la transplantation rénale est généralement faible. Cependant, notre laboratoire a maintenu un taux de réussite élevé (> 90%) de la transplantation rénale. Les points clés de la réussite sont de réduire les lésions de reperfusion au rein d'un donneur à la fois et les bénéficiaires, et de minimiser les saignements et des thromboses long de la procédure et post-opératoire. Les facteurs suivants peuvent être les plus importants: (a) réduire le saignement chez le receveur lors de la chirurgie autant que possible par l'exploitation prudents et doux; (b) minimiser les temps chauds ischémiques et clampage lors de la préparation rein d'un donneur et le receveur de transplantation; (c) utiliser un patch petit donateur la vessie afin de prévenir la nécrose, l'approvisionnement en sang insuffisant et fuites urinaires post-opératoires; néphrectomie retard (d) du rein natif jusqu'à 4 ~ 7 jours après la transplantation afin de permettre le rein transplanté à récupérer la fonction après la chirurgie; (e ) effectuer des anastomoses (entre le brassard aortique donateurs et la paroi antérieure et entre le brassard aortique donateurs et la paroi postérieure de l'aorte du destinataire) à l'extérieur de l'aorte afin de réduire l'incidence de la thrombose; (f) tenir souris receveuses chaude pendant au moins pour les 24 heures suivant la chirurgie; (g) donner des antibiotiques aux souris receveuses post-opératoire pour prévenir les infections potentielles.

Dans ce protocole, nous utilisons 10-0 au lieu de 11-0 de suture sans affecter le taux de survie. Bien que la suture 11-0 est idéal et utilisés dans les laboratoires de transplantation nombreuses, nous pensons que 10-0 suture est suffisante pour une utilisation en transplantation rénale tant que les facteurs décrits ci-dessus sont bien contrôlés.

L'ablation du rein indigènes restantes est essentielle pour que déclin de la fonction du greffon rénal peut être contrôlée par des mesures de la créatinine sérique. Tous les bénéficiaires greffe de rein subissent une néphrectomie du rein gauche natif entre 4 et 7 jours de transplantation rénale de poste. La néphrectomie n'est pas effectuée au moment de la transplantation rénale, car les destinataires caractéristiquement mauvaise santé ou ne survivent pas lorsque les deux procédures sont menées en même temps. Un décalage de 4 à 7 jours entre les procédures de permis de la greffe de rein pour se remettre de lésions d'ischémie-reperfusion avant le rein natif est enlevée. La fonction du greffon rénale est évaluée par des examens quotidiens de la santé animale globale et les niveaux de créatinine sanguine. Pour référence, un non-transplantés, souris normale a un niveau de créatinine d'environ 20 micromol / L. Le rejet d'allogreffe rénale est suspectée lorsque la souris receveuse montre des signes de la maladie et le niveau de créatinine sont élevés près de 100 micromol / L au cours de laquelle le temps greffes sont récoltées pour analyse histopathologique.

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Disclosures

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par le IACUC Ohio State University.

Acknowledgments

Ces études ont été soutenues en partie par un financement par le NIH R01 AI36532 au GAH. Nous tenons à souligner l'appui exceptionnel de la greffe de la pathologie fournies par le Dr Tibor Nâdasdy, et les précieux conseils et de la prévoyance prévu par le regretté Dr Charles G. Orosz à initier cet effort de recherche.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
i-STAT Other HESKA Cat 5101
i-STAT Cartridge Other HESKA CAT 5110-CREA
Sulfatrim Other Actavis R02109
Isoflurane Other NOVAPLUS CA-0474
10-0 Suture Surgery Sharpoint AK0100

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References

  1. Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants. JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).
  2. Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16, (2), 103-109 (1995).
Murin procédure transplantation rénale
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Cite this Article

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).More

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).

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