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Biology

Murine 신장 이식 절차

doi: 10.3791/1150 Published: July 10, 2009

Summary

생쥐의 신장 이식은 성공을위한주의 이후 수술 진료와 치료를 필요로하는 기술적으로 도전적인 절차입니다.

Abstract

생쥐의 신장 이식 orthotopic은 기술적으로 도전적인 절차입니다. 생쥐에서 처음으로 신장 이식이 (1) 벌써 30 년 동안 러셀 외 수행하고 년후 장 외 (2)에 의해 정제했지만, 세계에서 몇 사람이 프로 시저를 마스터했습니다. 저희 연구실에서는 성공적으로> 90 % 생존율과 1200 orthotopic 신장 transplantations을 수행했습니다. 성공을위한 핵심 포인트는 두 절차 및 사후 이식하는 동안 reperfusion 상해, 출혈 및 혈전증의 엄격한 통제를 포함하고, anastomoses 대신 11-0 봉합사의 10-0 중 하나를 사용하십시오.

받는 사람의 포스트 수술 관리 및 치료 성공과 평가를 이식하기 위해 매우 중요합니다. 모든 신장 이식의 수신자는 즉시 페니실린의 주사 지속적으로 마시는 물 속에 포스트 이식과 sulfatrim의 형태로 항생제를받을 수 있습니다. 전체 동물의 건강은 매일 전체 혈액 크레아티닌 분석이 이식편 기능을 평가하기위한 휴대용 I - STAT 기계와 함께 정기적으로 수행 평가됩니다.

Protocol

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기증자 장기 적출 수술 (2) :

  1. 65mg/kg pentobarbital IP를 사용하여 기증자를 마취, 마취는 Isoflurane (2-3 %)에 의해 유지됩니다.
  2. 기증자 복부를 입력하고 오른쪽 옆으로 소장 이동하여 왼쪽 신장을 폭로 가슴에서 치골에 정중선 절개를합니다.
  3. 8-0 실크 봉합사와 부신과 고환 혈관 ligating과 나누어 왼쪽 신장을 분리.
  4. 신장 동맥과 정맥과의 접합 위의 대동맥을 준비 시켜라.
  5. 신장 동맥과 정맥과의 접합부 위 아래 하부 대정 맥 (IVC)을 동원.
  6. 출혈을 최소화하기 위해 8-0 실크 봉합사와 신장 동맥과 정맥 아래의 대동맥을 Ligate.
  7. 신장 hilum에서 방광 왼쪽 ureter을 해부하다.
  8. 방광 돔에서 caudad 철회를 사용하여 ureterovesical 접합을 폭로.
  9. 방광 - 투 - 방광 요도 문합를 통해 재건에 사용되는 왼쪽 ureterovesical 접합을 포함하는 방광의 엑사이스 작은 타원형의 패치. 오른쪽 ureter은 방광에 포함되어 있지 않습니다.
  10. 8-0 실크 봉합사와 신장 동맥과 정맥 아래 IVC를 Ligate.
  11. 신장 동맥과 정맥 위의 대동맥을 Ligate, 천천히 0.2 - 0.4ml 감기로 현장에서 그래프트를 perfuse, infrarenal 대동맥을 통해 링어의 락트 솔루션 heparinized.
  12. 8-0 실크 봉합사와 신장 동맥과 정맥 위의 IVC를 Ligate.
  13. IVC와의 교차점에서 신장 정맥을 가로로 쪼개다.
  14. 신장 동맥 아래 약 2mm, obliquely 대동맥을 나눕니다.
  15. 신장과 연방 EN 방광 패치에 연결된 ureter와의 혈관 공급을 제거합니다. 얼음 링어의 락트 산 용액에 보관하십시오.
  16. 마취하에 자궁 경부 전위에 의해 기증 마우스를 안락사.

받는 사람 이식 (2) :

  1. 65 MG / kg pentobarbital IP를받는 사람을 마취와 Isoflurane으로 마취 (2-3 %)를 유지합니다.
  2. , 정중선 절개를 확인 서부 유럽 표준시 거즈로 소장을 커버하고 조심스럽게 왼쪽으로 철회.
  3. 오른쪽 ureter, 신장 동맥과 정맥을 Ligate, 오른쪽 신장을 제거합니다.
  4. 조심스럽게 허리 지점을 ligating 이후 두 4 - mm microvasular 클램프와 infrarenal 대동맥과 IVC을 분리하고 교차 클램프.
  5. 대동맥의 전체 두께 10-0 나일론 봉합사를 놓고 한 컷 (선박의 직경의 5 분의 1 정도)하여 타원형 aortaotomy를 만들기 위해 철회.
  6. 30 게이지 바늘로 IVC를 관통하고 적절하게 microscissors를 사용하여 확장하여 길이 venotomy하십시오.
  7. intraluminal 혈액이나 혈전을 취소 heparinized 호수와 대동맥과 IVC 모두 관개.
  8. 얼음에서 기증자의 신장을 제거하고 마우스의 오른쪽 측면에 내부 abdominally 그것을 놓으십시오. 기증자 신장은 차가운 호수 - 절어 거즈 패드와 함께 촉촉한 보관됩니다.
  9. 기증자의 대동맥을 재는 완과받는 사람의 aortaotomy의 근위 및 말초 꼭대기에 두 개 숙박 봉합합니다.
  10. 대동맥의 외부에 2 ~ 3 연속 10-0 나일론 봉합을 사용하여 기증 대동맥 수갑을 채워받는 aortaotomy의 앞쪽에 벽을 사이의 엔드 - 투 - 사이드 문합를 확인합니다.
  11. 받는 사람의 좌측으로 기증자 신장 이식을 돌립니다. 기증자 대동맥 수갑을 채워받는 aortaotomy의 후부 벽 사이의 이전 절차를 반복
  12. IVC의 내부에 4-5 지속 10-0 나일론 봉합을 사용하여 기증자 신장 정맥과받는 사람 IVC의 후부 벽 사이의 엔드 - 투 - 사이드 문합을 수행합니다. 그리고 IVC 및 기증자 신장 정맥의 앞쪽에 벽은 IVC 외부 4 ~ 5 연속 봉합과 함께 폐쇄됩니다.
  13. 정맥과 동맥 모두의 문합 20 분 이내에 완료해야합니다.
  14. 문합 동안 차가운 식염수로 여러 번 그래프트를 씻어.
  15. 받는 사람 방광의 돔을 분할하고, 소작과 함께 출혈이 중지합니다.
  16. 돔에 작은 절개를합니다.
  17. 받는 사람의 방광 돔와 기증자 작은 방광 패치를 anastomize에 10-0 나일론의 두 숙박 봉합를 놓습니다. 문합의 각 측면은 8 ~ 10 연속 봉합사와 봉합합니다.
  18. 연속 4-0 무균, 합성 흡수성 봉합사 vicryl 두 레이어의 복부를 닫습니다.
  19. 간헐 주입 IV에 의해 수술 도중에받는 생쥐에게 0.4ml 따뜻한 호수주세요.

수신자의 포스트 수술 케어

  1. 복부를 닫은 후, 페니실린 (500U/10g)의 하나 근육내 주사는 (2) 관리합니다.
  2. 또한, 수신자가 고통을 하루 종일 0 1 일 게시 수술에 intramuscularly 0.05 밀리그램 / kg buprenorphine를 받게됩니다. 실험 테 때까지 수술 후, 이식 수신자 sulfatrim (100mg/kg)를 포함하는 물을받을 수rminated.
  3. 첫 24 시간에 대한 postoperatively 생쥐는 배양기를 제어 온도에 보관하고 있습니다.
  4. 마우스는 일반적으로 작업을 1 시간 이내에 마취에서 회복하고 정기적으로 음식과 물 광고 libitum 부여됩니다.
  5. 피부 봉합 2 주 수술 후 제거됩니다.

수신자 신

  1. 65 MG / kg pentobarbital IP를받는 4 ~ 7 일 포스트 신장 이식 마취, 마취는 Isoflurane (2-3 %)에 의해 유지됩니다.
  2. 정중선 절개를 통해 복부를 엽니다.
  3. 생리 - 젖었 거즈로 소장을 커버하고 신중하게 오른쪽으로 철회.
  4. 왼쪽 ureter, 신장 정맥과 동맥을 ligating 후 왼쪽 신장을 제거합니다.
  5. 연속 4-0 합성 흡수성 봉합사 vicryl 두 레이어의 복부를 닫습니다.

전체 혈액 크레아티닌 측정

  1. 미만 0.2 CC의 격주 혈액 컬렉션 주간은 Isoflurane 마취 마취 또는 역 orbitally없이도 submandibularly 수행됩니다.
  2. 양적 전체 혈액 크레아티닌 수치는 I - 합계 휴대용 임상 분석기 (Heska 공단, 포트 콜린스, CO)를 사용하여 결정됩니다.
  3. 종래의 단위 (MG / DL)은 88.4로 종래의 단위를 곱하여 micromol / L의 SI 단위로 변환됩니다.

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Discussion

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우리는> 90 % 기술 성공률과 마우스에서 신장 이식의 약 1천2백가지 경우을 수행했습니다. 심장 이식에 비해 신장 이식의 성공률은 일반적으로 낮다. 그러나, 저희 연구실은 신장 이식의 높은 성공률을 (> 90%) 유지하고 있습니다. 성공을위한 핵심 포인트는 기증자의 신장과받는 사람 모두에게 reperfusion의 부상을 감소하고, 절차 및 사후 operatively 전역 출혈 및 혈전증을 최소화하는 것입니다. 다음과 같은 요인이 가장 중요한 수 있습니다 : (A) 수술하는 동안받는 사람의 피를 최대한 신중하고 부드러운 동작을 통해를 줄이고, (B) 기증 신장 준비와 수신자 이식하는 동안 따뜻한 허혈성 및 교차 클램핑 시간을 최소화하고, (C) 괴사, 불충 분한 혈액 공급 및 방광 유출 수술을 방지하기 위해 작은 기증자 방광 패치를 사용하여, 원래 신장의 (D) 지연 신 사까지 ~ 칠일 후 이식 이식 신장 수술 다음과 같은 기능을 복구할 수 있도록, (E ) 혈전증의 발생을 줄이기 위해 대동맥 밖 anastomoses을 (기증 대동맥 수갑을 채워 앞쪽에 벽 사이에 기증 대동맥 수갑을 채워받는 사람의 대동맥의 후부 벽 사이) 수행, (F) 적어도 용받는 쥐가 보온 24 시간 수술에 따라, (G) 잠재적인 감염을 방지하기 위해 사후 operatively받는 마우스로 항생제를 제공합니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 생존율에 영향을주지 않고 대신 11-0 봉합사의 10-0 사용합니다. 11-0 봉합사 이상적 많은 이식 연구소에서 사용되고 있지만, 우리는 위에서 설명한 요소를 잘 제어로 10-0 봉합 길이로 신장 이식에 사용하기 위해 충분하다고 생각합니다.

신장 이식 기능에 저하가 혈청 크레아티닌 측정에 의해 모니터할 수 있도록 남아있는 원시 신장의 제거는 필수적입니다. 모든 신장 이식의 수신자는 4 ~ 7 일 포스트 신장 이식의 왼쪽 기본 신장의 신을 받고있다. 수신자가 특질상 아픈 건강을 고통 또는 둘 다 절차가 동시에 진행하는 경우 생존하지 않기 때문에 신은 신장 이식 시에 수행되지 않습니다. 절차 간의 4~7일 지연은 원래 신장이 제거되기 전에 신장 이식은 국소 빈혈과 reperfusion 부상에서 회복하기 위해 수 있습니다. 신장 이식 기능은 전체 동물의 건강과 혈액 크레아티닌 수준의 일상적인 시험에 의해 평가됩니다. 참고로, 비 이식, 정상적인 마우스는 약 20 micromol / L.의 크레아티닌 수준을 가지고 신장 allograft 제거는받는 마우스가 질병의 흔적을 보여줍니다 및 크레아티닌 수준 100 micromol / L 시간 이식이 histopathological 분석을위한 수확되는에 가까운 고가 때 의심됩니다.

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Disclosures

동물 실험은 오하이오 주립 대학 IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

Acknowledgments

이러한 연구 GAH에 NIH R01 AI36532에 의해 기금에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 박사 Tibor Nadasdy에서 제공하는 이식 병리학의 뛰어난 지원을 인정하고,이 연구 노력을 시작으로 후반 박사 찰스 G. Orosz에서 제공하는 귀중한지도 데다가 것입니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
i-STAT Other HESKA Cat 5101
i-STAT Cartridge Other HESKA CAT 5110-CREA
Sulfatrim Other Actavis R02109
Isoflurane Other NOVAPLUS CA-0474
10-0 Suture Surgery Sharpoint AK0100

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References

  1. Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants. JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).
  2. Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16, (2), 103-109 (1995).
Murine 신장 이식 절차
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Cite this Article

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).More

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).

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