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Biology

Murino Procedimento de Transplante Renal

doi: 10.3791/1150 Published: July 10, 2009

Summary

Transplante renal em ratos é um procedimento tecnicamente desafiador que requer cuidados pós-operatórios cuidado e tratamento para o sucesso.

Abstract

Transplante renal ortotópico em ratos é um procedimento tecnicamente desafiador. Embora o primeiro transplante renal em ratos foram realizadas por Russell et al mais de 30 anos (1) e refinada por Zhang et al anos depois (2), poucas pessoas no mundo têm dominado este procedimento. Em nosso laboratório temos realizado com sucesso 1.200 transplantes renais com ortotópico> taxa de sobrevivência de 90%. Os pontos-chave para o sucesso incluem o controle rigoroso do sangramento reperfusão, e trombose, tanto durante o procedimento e pós-transplante, e uso de 10-0, em vez de 11-0 sutura para anastomoses.

Pós-operatório cuidados e tratamento do destinatário é extremamente importante para o sucesso do transplante e da avaliação. Todos os destinatários do enxerto renal receber antibióticos sob a forma de uma injeção de penicilina imediatamente pós-transplante e sulfatrim na água de beber continuamente. Saúde animal global é avaliado diariamente e análises de creatinina no sangue são realizados rotineiramente com uma máquina portátil I-STAT para avaliar a função do enxerto.

Protocol

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Colheita de doadores de órgãos (2):

  1. Anestesiar o doador utilizando 65mg/kg IP pentobarbital; anestesia é mantida por isoflurano (2-3%).
  2. Faça uma incisão na linha média do esterno às pubis para entrar no abdômen do doador e expor o rim esquerdo, deslocando o intestino lateralmente para o lado direito.
  3. Isolar o rim esquerdo por ligadura e dividindo os vasos adrenal e testicular com um fio de seda 8-0.
  4. Mobilizar a aorta acima de sua junção com a artéria e veia renal.
  5. Mobilizar a veia cava inferior (VCI) acima e abaixo de sua junção com a artéria e veia renal.
  6. Ligadura da aorta abaixo da artéria renal e veia com um fio de seda 8-0 para minimizar o sangramento.
  7. Dissecar o ureter esquerdo do hilo renal até a bexiga.
  8. Expor a junção ureterovesical usando retração caudal na cúpula da bexiga.
  9. Especiais de consumo um patch, pequena elíptica da bexiga contendo a junção ureterovesical esquerdo, utilizado para a reconstrução urinária através de uma anastomose da bexiga a bexiga. O ureter direito não está incluído com a bexiga.
  10. Ligadura da VCI abaixo da artéria renal e veia com um fio de seda 8-0.
  11. Ligadura da aorta acima da artéria renal e veia e, lentamente, perfundir o enxerto in situ com 0,4 ml de 0,2 frio, heparinizado solução de Ringer lactato através da aorta infra-renal.
  12. Ligadura da VCI acima da artéria renal e veia com um fio de seda 8-0.
  13. Transecto da veia renal na sua junção com o IVC.
  14. Divida a aorta obliquamente, cerca de 2 milímetros abaixo da artéria renal.
  15. Remover o rim e sua fonte vascular com ureter anexado ao remendo de bexiga em bloco. Loja em solução Ringer com lactato no gelo.
  16. Euthanize o mouse doador por deslocamento cervical sob anestesia.

Transplante de destinatário (2):

  1. Anestesiar o destinatário IP com 65 mg / kg pentobarbital e manter a anestesia com isoflurano (2-3%).
  2. Faça uma incisão na linha média, cobrir o intestino com uma gaze molhada e com cuidado retirar-la para o lado esquerdo.
  3. Ligadura do ureter direito, artéria e veia renal, e remover o rim direito.
  4. Cuidadosamente isolar e cross-clamp da aorta infra-renal e veia cava inferior com duas pinças de 4 mm microvasular após a ligadura dos ramos lombares.
  5. Coloque um fio de náilon 10-0 através de uma espessura total de aorta e retrair para fazer uma aortaotomy elíptica por um único corte (cerca de um quinto do diâmetro do vaso).
  6. Faça uma venotomia longitudinal perfurando a veia cava inferior com uma agulha de calibre 30 e estender adequadamente com microtesoura.
  7. Irrigar tanto a aorta e veia cava inferior com solução salina heparinizada para limpar o sangue intraluminal ou coágulos.
  8. Remover o rim de doador do gelo e coloque-o intra-abdominal no flanco direito do mouse. O rim do doador é mantida úmida com uma gaze embebida com solução salina fria.
  9. Coloque duas suturas permanecer no ápice proximal e distal do aortaotomy destinatários com a braçadeira aórtica doadores.
  10. Faça uma anastomose término-lateral entre a braçadeira aórtica doador ea parede anterior do aortaotomy destinatários, utilizando 2 ~ 3 contínua 10-0 suturas de nylon na parte externa da aorta.
  11. Vire o enxerto renal de doador até o flanco esquerdo do destinatário. repita o procedimento anterior entre a braçadeira aórtica doador ea parede posterior da aortaotomy destinatários
  12. Executar uma anastomose término-lateral entre a veia do doador renal e da parede posterior da VCI destinatários, utilizando 4-5 contínua 10-0 suturas de nylon no interior da VCI. e, em seguida, a parede anterior do IVC e doadores veia renal são fechadas com 4 ~ 5 sutura contínua fora da VCI.
  13. Anastomose da veia e artéria ambos deve ser concluído dentro de 20 minutos.
  14. Lavar o enxerto com solução salina fria várias vezes durante a anastomose.
  15. Divide a cúpula da bexiga destinatário, e parar o sangramento com cauterização.
  16. Faça um pequeno corte na cúpula.
  17. Coloque duas suturas estadia de nylon 10-0 para os doadores anastomize bexiga pequena mancha com a cúpula da bexiga destinatários. Cada lado da anastomose é suturada com 8 ~ 10 pontos contínuos.
  18. Fechar o abdômen em duas camadas com 4-0 estéril, fio absorvível sintético vicryl.
  19. Dê ratos destinatário salina morna 0,4 ml durante a cirurgia por injeção intermitente IV.

Cuidados pós-operatórios de destinatário

  1. Após o fechamento do abdome, uma única injeção intramuscular de penicilina (500U/10g) é administrado (2).
  2. Além disso, os destinatários recebem buprenorfina 0,05 mg / kg por via intramuscular no dia 0 e cirurgia dia pós 1 para dor. Após a cirurgia, pacientes transplantados recebem água contendo sulfatrim (100mg/kg) até que o experimento é terminated.
  3. Para primeiras 24h pós-operatório os ratos são mantidos em uma temperatura controlada incubadora.
  4. Camundongos geralmente se recupera da anestesia dentro de 1 hora da operação e recebem comida regular e água ad libitum.
  5. Suturas são removidas duas semanas após a cirurgia.

Destinatário nefrectomia

  1. Anestesiar o destinatário 4 ~ 7 dias pós-transplante renal com 65 mg / kg IP pentobarbital; anestesia é mantida por isoflurano (2-3%).
  2. Abrir o abdómen através de uma incisão mediana.
  3. Cobrir o intestino com solução salina, gaze e com cuidado retirar-la para o lado direito.
  4. Remover o rim esquerdo após ligadura à esquerda ureter veia renal e artéria.
  5. Fechar o abdômen em duas camadas com fio absorvível 4-0 vicryl sintéticos.

As determinações de creatinina Sangue Total

  1. Semanais para coleta de sangue a cada duas semanas, inferior a 0,2 cc é realizada submandibularly sem anestesia ou retro-orbital sob anestesia isoflurano.
  2. Quantitativas dos níveis de creatinina no sangue são determinados utilizando um I-Stat Analyzer portátil Clínica (Heska Corp, Fort Collins, CO).
  3. Unidades convencionais (mg / dl) são convertidos em unidades SI de micromol / L multiplicando as unidades convencionais por 88,4.

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Discussion

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Efetuamos cerca de 1200 casos de transplante renal em ratos com uma taxa de sucesso técnico de> 90%. Comparado com o transplante cardíaco, a taxa de sucesso de transplante renal é geralmente baixa. No entanto, nosso laboratório tem mantido uma alta taxa de sucesso (> 90%) de transplante renal. Os pontos-chave para o sucesso são para reduzir as lesões de reperfusão a ambos os rins de doadores e receptores, bem como minimizar o sangramento e trombose durante todo o procedimento e pós-operatório. Os seguintes fatores podem ser mais importantes: (a) reduzir o sangramento no receptor durante a cirurgia, tanto quanto possível através de uma operação cuidadosa e gentil; (b) minimizar o tempo de isquemia quente e pinçamento durante a preparação do doador de rim e do receptor de transplante; (c) use um patch bexiga pequena de doadores para evitar necrose, suprimento insuficiente de sangue e vazamento da bexiga pós-operação, (d) atraso nefrectomia do rim nativo até 4 ~ 7 dias pós-transplante para permitir que o rim transplantado para recuperar a função após a cirurgia; (e ) realizar anastomoses (entre a braçadeira aórtica doador ea parede anterior e entre a braçadeira aórtica doador ea parede posterior da aorta do destinatário) fora da aorta para reduzir a incidência de trombose; (f) manter os ratos destinatário morna por pelo menos por 24 horas após a cirurgia, (g) dar antibióticos para ratos destinatário no pós-operatório para evitar possíveis infecções.

Neste protocolo, usamos 10-0 11-0 em vez de sutura sem afetar taxa de sobrevivência. Embora a sutura 11-0 é ideal e usado em muitos laboratórios transplante, sentimos que 10-0 sutura é suficiente para uso em transplante renal, enquanto os factores acima descritos estão bem controlados.

A remoção do rim remanescente nativa é essencial para que o declínio na função do enxerto renal pode ser monitorado por meio de medições de creatinina sérica. Todos os destinatários do enxerto renal submetidos a nefrectomia do rim esquerdo nativa entre 4 e 7 dias pós-transplante renal. Nefrectomia não é realizada no momento do transplante renal porque os receptores caracteristicamente sofrem problemas de saúde ou não sobreviver quando ambos os procedimentos são realizados ao mesmo tempo. Um dia lag 4-7 entre os procedimentos permite que o enxerto renal se recuperar de lesão de isquemia e reperfusão renal antes do natal é removido. Função do enxerto renal é avaliada por exames diários de saúde animal em geral e os níveis de creatinina no sangue. Para referência, um não-transplantados rato normal, tem um nível de creatinina de cerca de 20 micromol / L. Rejeição do enxerto renal é suspeita quando o mouse destinatário mostra sinais da doença eo nível de creatinina estão elevados perto de 100 micromol / L em que enxertos tempo são colhidas para análise histopatológica.

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Disclosures

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela The Ohio State University IACUC.

Acknowledgments

Estes estudos foram suportados em parte pelo financiamento pelo NIH R01 AI36532 para GAH. Gostaríamos de agradecer o apoio de destaque no transplante de patologia fornecidos pelo Dr. Tibor Nadasdy, ea orientação de valor inestimável e previsão fornecida pelo falecido Dr. Charles G. Orosz em iniciar este esforço de pesquisa.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
i-STAT Other HESKA Cat 5101
i-STAT Cartridge Other HESKA CAT 5110-CREA
Sulfatrim Other Actavis R02109
Isoflurane Other NOVAPLUS CA-0474
10-0 Suture Surgery Sharpoint AK0100

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References

  1. Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants. JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).
  2. Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16, (2), 103-109 (1995).
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Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).More

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).

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