に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚
Summary
このプロトコルは、マイクロインジェクションとで高解像度の画像の使用について説明<em>キイロショウジョウバエ</em有糸分裂を勉強する>シンシチウム胚。
Abstract
このプロトコルは、有糸分裂1を研究するためのキイロショウジョウバエ合胞体胚の使用について説明します。 ショウジョウバエは 、シーケンスされたゲノムを持つ有用な遺伝学があり、そしてそれは容易に維持して操作することができます。多くの有糸分裂変異体が存在し、（例えばGFP）蛍光機能を発現するトランスジェニックハエ – タグ分裂タンパク質がされていると生成されています。標的遺伝子の発現は、GAL4/UASシステム2を使って可能です。
ショウジョウバエ初期胚では、（細胞周期の期間、≈10分）非常に迅速に複数の分裂像を実施。サイクル10から13の間に、核がちょうど皮質下に単分子層で胚の表面に細胞質分裂を介在することなく、迅速にかつ同期的に分割するので、これはよく、画像有糸分裂に適しています。これらの急速に分裂する核は、おそらく他の細胞と同じ有糸分裂機構を使用しますが、それらは高速化のために最適化され、チェックポイントは、一般的に不在の強いチェックポイントを有する細胞の細胞周期停止を引き起こす細胞分裂タンパク質の研究を可能にする、厳格ではないと考えられている。またはGFP標識タンパク質を発現している胚は蛍光標識したタンパク質をマイクロインジェクションは、簡単にライブダイナミクス（図1）に従うために撮像することができます。さらに、胚は、その機能3の喪失または摂動の効果を研究するために特定のタンパク質の機能阻害抗体や阻害剤をマイクロインジェクションすることができます。これらの試薬は、その変異体の対立遺伝子のシリーズに匹敵する欠陥の勾配でターン結果の阻害剤の濃度の勾配を、生成するために多くのスピンドルに達し、胚全体に拡散することができます。理想的には、標的タンパク質を蛍光標識されている場合、阻害の勾配は、4を直接可視化することができる。それは正式に抗体を適用する必要があるまれなので、厳格なコントロールと慎重な解釈で支配的な影響を与えることがあるという可能性を排除するのは難しいですが、それは、最強の表現型がnull表現型と同程度であることを前提としています。遠くに注射部位から、タンパク質の機能は部分的にしか標的タンパク質の他の機能が明らかになることを可能にすることが失われている。
Protocol
Discussion
このプロトコルは比較的簡単です、しかし、各ステップでは、胚が損傷していないことを確認する練習が必要です。慎重な対照実験は常に信頼性の高い結果が得られていることを保証するために行われる必要があります。この設定を開始する一つの良い方法は、有糸分裂が胚の表面（サイクル10から13）ですべてのサイクルを通じて正常に進行することを確認するためにGFP -チューブリンの発?…
Acknowledgements
このプロトコルは、現在我々の研究室で使用されており、博士デビッドシャープ、Mijungクォン、パトリツィアSommi、Dhanya Cheerambathurを含む多くの人々が長年にわたって洗練されています。我々はこのシステムでは我々の作業が開始されていた初期のショウジョウバエの胚の操作およびマイクロインジェクション（参考文献13）に優れたアドバイスを私たちに提供する博士ビルサリバン（UCSC）に感謝。我々はコーリーの研究室のすべてのメンバーに感謝。 ショウジョウバエの有糸分裂に関する私たちの仕事は、NIHの助成金GM55507によってサポートされています。
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