Techniques de microinjection pour l'étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

Summary

Ce protocole décrit l'utilisation de micro-injection et l'imagerie à haute résolution dans le

Abstract

Ce protocole décrit l'utilisation de l'embryon de Drosophila melanogaster pour l'étude de la mitose syncytial ^1. Drosophile a la génétique utile avec un génome séquencé, et il peut être facilement entretenu et manipulé. Il existe de nombreux mutants mitotique, et les mouches transgéniques exprimant fonctionnelle par fluorescence (par exemple GFP) - protéines mitotiques étiquetés ont été et sont générés. L'expression du gène ciblé est possible en utilisant le système GAL4/UAS ^2.

La drosophile embryon précoce effectue mitoses multiples très rapidement (durée du cycle cellulaire, ≈ 10 min). Il est bien adapté pour l'imagerie de la mitose, parce que pendant les cycles de 10-13, les noyaux se divisent rapidement et de manière synchrone, sans intervenir cytokinèse à la surface de l'embryon dans une seule monocouche juste en dessous du cortex. Ces noyaux se divisent rapidement probablement utiliser la machinerie mitotique même que d'autres cellules, mais ils sont optimisés pour la vitesse, le checkpoint est généralement admis de ne pas être rigoureux, permettant l'étude des protéines mitotique dont l'absence entraînerait l'arrêt du cycle cellulaire dans les cellules avec un checkpoint forte . Embryons exprimant des protéines GFP étiqueté ou microinjectés avec des protéines marquées par fluorescence peut être facilement imagée de suivre la dynamique en direct (Fig. 1). En outre, les embryons peuvent être microinjectés avec fonction de blocage des anticorps ou des inhibiteurs de protéines spécifiques à étudier l'effet de la perte ou la perturbation de leur fonction ^3. Ces réactifs peuvent diffuser dans tout l'embryon, atteignant plusieurs fuseaux pour produire un gradient de concentration de l'inhibiteur, ce qui entraîne à son tour dans un gradient de défauts comparables à une série allélique de mutants. Idéalement, si la protéine cible est marqué par fluorescence, le gradient d'inhibition peut être visualisé directement ^4. Il est supposé que la plus forte phénotype est comparable à l'phénotype nul, mais il est difficile d'exclure formellement la possibilité que les anticorps peuvent avoir des effets dominante dans de rares cas, des contrôles afin rigoureuse et une interprétation prudente doit être appliquée. Plus loin du site d'injection, la fonction des protéines n'est que partiellement perdue permettant d'autres fonctions de la protéine cible à devenir évidents.

Protocol

Recettes:

Plaques Jus de raisin:

• 5.5g bacto agar
• 14,5 g de dextrose ou de glucose
• 7,15 g de saccharose
• 45 ml de concentré de jus de raisin (jus 100%).
• 204,5 ml d'H ₂ 0
• 625 ul de NaOH 10N

Mélanger tous les ingrédients et les micro-ondes jusqu'à ébullition.
Ajouter 2,8 ml d'acide mélange (mix d'acide: 20,9 ml d'acide propionique, 2,1 ml d'acide phosphorique, 27 ml de H ₂ 0)

Mélangez et versez sur 35 boîtes de Pétri mm. Laisser solidifier à température ambiante pendant un ou deux jours. Si les plaques ne vont pas être utilisés rapidement, sceller avec du parafilm et de garder à 4 ° C (laisser s'équilibrer à température ambiante avant de l'utiliser).

Pâte de levure:

Dissolvez environ une cuillère à café de levure (Sigma YSC2, levure de Saccharomyces cerevisiae type II) dans l'eau pour former une pâte épaisse. Placer une petite quantité de ce sur chaque assiette de jus de raisin, juste avant utilisation.

G-PEM mémoire tampon:

• 80 mM de Na-PIPES, pH 6,9
• MgCl2 1 _mM
• 1 mM d'EGTA
• 1 mM GTP

Tampon d'injection:

• 150 mM de K-aspartate
• 10 mM de K-phosphate
• 20 mM imidazole, pH 7,2

Colle Heptane:

Dérouler ruban adhésif double collant et le placer dans une bouteille 100ml, ajouter environ 50 ml d'heptane, sceller la bouteille, et le rock pendant plusieurs jours. Lors de l'utilisation, ajouter heptane si la colle est trop épaisse.

Chambre de déshydratation:

Prenez une boîte de Petri de 100 mm, mettre une partie d'un plat de 35 mm à l'intérieur pour faire une «table» et d'ajouter Drierite (sulfate de calcium anhydre) autour de lui afin que la hauteur des Drierite n'est pas plus élevé que la «table» et couvrir. La lamelle avec des embryons sera mis sur cette "table" pour déshydratation avant l'injection. C'est une bonne idée d'utiliser au moins quelques Drierite indiquant et le changer quand il a changé de couleur.

Protocole:

Ce protocole peut être utilisé pour l'injection de pratiquement tous les réactifs solubles dans l'embryon de drosophile syncytial: Par exemple, soit une protéine fluorescente pour l'observation ou un inhibiteur de la protéine cible ou les deux.

Obtenir tout est prêt:

1 .- 2 à 3 jours avant l'expérience, faire des plaques de jus de raisin et de mettre en place jeter en cage: Prendre une bouteille en plastique (6 oz, à fond rond de scientifique appliquée drosophile), couper deux petits trous (environ 1cm ²⁾ sur les côtés opposés du bouteille et remplissez avec un morceau de coton (ce qui permettra une circulation d'air), appuyez sur les mouches dans la bouteille et couvrir avec une assiette de jus de raisin. Gardez à 25 ° C (ou température ambiante), les mouches devraient définir les embryons pendant environ 10 jours.

2 .- Au moins un jour avant l'expérience tirez aiguilles pour l'injection, on utilise une aiguille Kopf / pipette extracteur de modèle 720 et minces filaments de verre à paroi (World Precision Instruments tw100f). Pour l'injection de tubuline fluorescente, gardez aiguilles à 4 ° C pour empêcher la température induite par polymérisation dans l'aiguille.

Préparation de la tubuline:

Remarque: Tous les travaux avec la tubuline devrait être fait à 4 ° C pour empêcher la polymérisation.

1. Prenez la tubuline étiquetés hors du congélateur et le mettre sur la glace pendant 5 à 15 minutes.
2. Diluer avec le G-PEM tampon (4 à 10 fois selon l'intensité requise).
3. Centrifuger à 13k rpm à 4 ° C pendant 10-15 minutes.
4. Charge de 1 à 2 ul dans l'aiguille.

Anticorps ou d'un inhibiteur chimique:

Préparer aiguilles comme pour la tubuline, en utilisant une concentration appropriée (ce peut être nécessaire de tester). L'anticorps peut être dans le tampon d'injection, le G-PEM tampon ou PBS. Si un autre tampon est nécessaire, ce tampon devra être injectée comme un contrôle pour s'assurer que ce tampon provoque pas de dégâts sur son propre.

Remarque: la tubuline inhibiteur et fluorescentes peuvent être mélangés et injectés ensemble, si les concentrations le permettent. Sinon, injecter la tubuline fluorescente et attendre 5 à 10 minutes avant l'injection de l'inhibiteur. Lorsque vous effectuez une double injection, commencer avec plus d'embryons, car moins d'embryons va récupérer normalement.

Collecte d'embryons:

1. Mettez une plaque de raisin jus de nouvelles sur la cage laïcs.
2. Retirez cette plaque au bout d'une heure, il s'agit de la première collection de la journée et ne sont souvent pas très bon. Il peut être mis au rebut.
3. Changer la plaque toutes les heures pour garder les embryons de collecte pour une heure chacune.

Préparation de la lamelle:

1. Mettre une lamelle de 50 x 22mm sur un côté d'une lame de microscope. Bande des quatre coins de la lame de sorte qu'il ne bouge pas.
2. En utilisant un coton-tige, placez une couche de colle heptane en une seule ligne sur la lamelle (la colle ne doit pas être visqueux et doit sécher en quelques secondes, sinon ajouter plus heptane).
3. Placer un morceau dedoubles ruban adhésif sur la lame vers le côté de la lamelle.

Préparation de l'embryon:

Remarque: Les embryons doivent être imagés environ 2 heures après le début de la collecte, afin de commencer les étapes suivantes laissant suffisamment de temps pour les terminer dans ce laps de temps.

1. Avec un pinceau imbibé soigneusement ramasser les embryons de la plaque de jus de raisin et le placer sur un ruban adhésif double glissière.
2. Utilisation de la partie externe de la pince à épiler, rouler les embryons au cours du ruban adhésif double collant jusqu'à la chorion (la membrane externe) Séjours ouverts.
3. Ramassez l'embryon par la doucement rouler sur le chorion de sorte qu'il colle à la pince à épiler et le placer sur la colle heptane sur la lamelle avec le côté long du parallèle embryon pour le côté long de la lamelle. Réglez hausse de 10 à 20 embryons dans une rangée.
4. Retirer la lamelle et la placer dans la chambre de déshydratation pour les 3 à 8 minutes (cela dépend de l'humidité de la pièce et la quantité à injecter).
5. Placer sur une enceinte métallique avec de la graisse à vide.
6. Couvrir les embryons avec 700 huile halocarbone pour éviter de nouvelles déshydratation. Les embryons sont maintenant prêtes pour l'injection.

L'injection d'embryons:

1. Trouvez les embryons dans un objectif 16x.
2. Déplacer les embryons loin, et de trouver l'aiguille sans déplacer le plan focal.
3. Centre de l'aiguille et le déplacer en place sans la déplacer en direction X ou Y.
4. Si l'aiguille n'est pas ouvert, placez le bord de la lamelle dans le champ de vision, mais pas là où l'aiguille sera, et abaisser l'aiguille au même plan focal. Très soigneusement déplacer la lamelle jusqu'à ce qu'il frappe l'aiguille et la douceur des pauses de l'ouvrir. Si l'aiguille est ouvert, passez à l'étape 5. (Aiguilles peuvent être ouvertes avec de l'acide fluorhydrique, avant le remplissage).
5. Mettez les embryons en vue (mais pas là où l'aiguille sera), abaisser l'aiguille dans l'huile et assurez-vous d'obtenir des gouttes de liquide bien de l'aiguille.
6. Soigneusement mais sûrement passer l'embryon dans l'aiguille et injecter une goutte dans l'embryon et l'embryon se déplacer loin. (Ou suivez les instructions de votre appareil d'injection).
7. Après que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts pour l'observation sur un microscope confocal.

Imagerie:

Image des embryons sur un microscope confocal avec un objectif de 60 ou 100X:
Notes:

1. L'intervalle de temps sur une série laps de temps devrait être au plus de quelques secondes, depuis la mitose chez l'embryon est très rapide, selon le processus exact d'être étudiée.
2. Une série en 3D ou un seul plan peut être acquis en fonction du procédé d'intérêt.
3. Pour les inhibiteurs à action rapide, le transfert du microscope injection microscope d'imagerie doit être rapide.

Figure 1: Étude de la mitose dans la drosophile embryon syncytial. Noyaux dans l'embryon précoce subissent des divisions rapides sans cytokinèse, lors des cycles de 10 à 13 former des noyaux d'une monocouche au niveau du cortex. Une. Schéma de l'embryon précoce avec des noyaux à cortex. Embryon peut exprimer la GFP et / ou DP protéines marquées et peuvent être microinjectés avec d'autres protéines marquées et / ou inhibiteurs. Imagerie B. laps de temps de l'embryon exprimant la GFP-tubuline et de la DP-histones. Plot C. pôle-pôle de séparation pour les cycles 11 , 12 et 13 dans un embryon de type sauvage. Longueur de la broche expositions des périodes de durée isométrique et des périodes d'allongement, qui sont très cohérents et reproductibles. Dynamique des microtubules D. broche. L'injection d'une faible concentration de tubuline conduit à la rhodamine taches formées d'un sous-unités de tubuline années, ce qui peut être utilisée pour étudier la dynamique des microtubules.

Discussion

Ce protocole est relativement simple, cependant, chaque étape requiert la pratique de s'assurer que les embryons ne sont pas endommagés. Expériences de contrôle minutieux toujours besoin d'être fait pour s'assurer que des résultats fiables sont obtenus. Une bonne façon de commencer ce n'est par la micro-injection de tubuline tampon ou la rhodamine dans des embryons de contrôle exprimant la GFP-tubuline afin de s'assurer que la mitose se déroule normalement dans tous les cycles à la surface d'embryon (cycles 10 à 13). Dans les embryons de contrôle vous ne devriez pas observer les connexions physiques entre les broches qui sont souvent le résultat d'une déshydratation trop, plus le temps de déshydratation. Lorsque les embryons sont endommagés, les retombées nucléaires est souvent observé, centrosomes libres ou espacement irrégulier des noyaux ou axes sont révélateurs de dommages. Parcelles du pôle-pôle à distance sont très reproductibles et sont une mesure très fiable de "succès", dans des embryons de contrôle qu'ils doivent ressembler à celles indiquées dans la figure 1.

Nous avons utilisé ce protocole à l'étude de nombreux aspects de l'assemblage du fuseau, la maintenance et l'allongement utilisant des anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux peptide ou dirigés contre la protéine d'intérêt ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13.} Inhibiteurs de la protéine spécifique ou d'autres produits chimiques qui affectent la protéine d'intérêt peut également être microinjectés et leurs effets observés et mesurés quantitativement. Pour évaluer l'effet d'un inhibiteur de particulier, nous comparons la longueur de la broche après inhibition à celui observé chez les embryons de contrôle. Nous pouvons aussi regarder la dynamique tubuline en utilisant fluorescent Microscopie chatoiement ¹⁴ après micro-injection d'une faible concentration de tubuline fluorescente (fig. 1d).

En général, nous recueillons pendant une heure et laissez embryons matures pour une heure de plus avant l'observation, ce qui signifie que les embryons sont entre 1 et 2 heures à peine quand on l'observe. Si les mouches pondent bien et beaucoup d'embryons sont collectés dans une heure, puis le temps de collecte peut être raccourcie de telle sorte que plus d'embryons synchrone-divisant sont obtenus. Si le timing de l'inhibition est critique ou d'intérêt pour l'étude, l'inhibiteur peut être injecté sous observation confocale. Cela est plus difficile, mais il est possible néanmoins.