يصف هذا البروتوكول استخدام microinjection وعالية الدقة في التصوير<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em> الجنين المخلوي لدراسة الانقسام.
يصف هذا البروتوكول استخدام الأجنة melanogaster ذبابة الفاكهة لدراسة الانقسام المخلوي 1. ذبابة الفاكهة والوراثة مفيدة مع تسلسل الجينوم ، ويمكن بسهولة أنها حافظت والتلاعب بها. وجود العديد من المسوخ الإنقسامية ، ومعربا عن الذباب المعدلة وراثيا وظيفية fluorescently (GFP مثلا) — البروتينات الإنقسامية الموسومة تم ويتم إنشاؤها حاليا. استهدفت التعبير الجيني هو ممكن باستخدام نظام GAL4/UAS 2.
الجنين في وقت مبكر ذبابة الفاكهة ينفذ mitoses متعددة بسرعة كبيرة (خلية مدة الدورة ، ≈ 10 دقيقة). وهو مناسب تماما عن الانقسام والتصوير ، لأنه خلال دورات 10-13 ، نواة الانقسام بسرعة وبشكل متزامن دون التدخل الحرائك الخلوية على سطح الجنين في أحادي الطبقة واحدة فقط تحت القشرة. هذه النوى تقسيم بسرعة على الأرجح استخدام الآلية الإنقسامية نفس الخلايا الأخرى ، ولكن ما هي الأمثل للسرعة ، ويعتقد عموما أن لا يكون نقطة تفتيش صارمة ، والسماح للدراسة البروتينات الإنقسامية الذي سيسبب عدم اعتقال خلية دورة في زنزانات مع نقطة تفتيش قوية . ويمكن التعبير عن البروتينات الأجنة GFP المسمى أو microinjected مع بروتينات fluorescently المسمى التقط بسهولة لمتابعة ديناميكية حية (الشكل 1). بالإضافة ، يمكن microinjected الأجنة مع وظيفة حجب الأضداد أو مثبطات لبروتينات محددة لدراسة تأثير فقدان أو اضطراب وظيفتها 3. يمكن لهذه الكواشف منتشر في جميع أنحاء جنين ، حيث بلغت مغزل لانتاج العديد من الانحدار تركيز مثبط ، والتي تؤدي بدورها في الانحدار من عيوب مماثلة لسلسلة أليلية من المسوخ. من الناحية المثالية ، إذا fluorescently المسمى البروتين المستهدفة ، ويمكن التدرج من تثبيط يمكن تصور مباشرة 4. فمن المفترض أن أقوى النمط الظاهري هو مشابه إلى النمط الظاهري فارغة ، على الرغم من أنه من الصعب استبعاد احتمال رسميا أن الأجسام المضادة قد تكون لها آثار المهيمنة في حالات نادرة ، والضوابط الصارمة وتفسير ذلك الحذر يجب أن يطبق. بعيدا عن موقع الحقن ، وظيفة البروتين هو فقط السماح فقدت جزئيا وظائف أخرى من البروتين المستهدف لتصبح واضحة.
هذا البروتوكول هو بسيط نسبيا ، ومع ذلك ، يتطلب ممارسة كل خطوة للتأكد من عدم تلف الأجنة. تجارب التحكم الدقيق دائما بحاجة إلى القيام به لضمان أن يتم الحصول على نتائج موثوقة. واحد وسيلة جيدة لبدء هذه هي microinjecting العازلة أو رودامين تويولين في التعبير عن السيطرة الأجنة GFP – ت…
ويجري حاليا استخدام هذا البروتوكول في مختبرنا وتم صقلها على مر السنين الكثير من الناس بمن فيهم الدكاترة ديفيد شارب ، كوون Mijung ، Sommi باتريسيا ، Cheerambathur Dhanya. نشكر الدكتور بيل سوليفان (UCSC) الذين قدموا لنا المشورة ممتازة على التلاعب وmicroinjection للأجنة ذبابة الفاكهة في وقت مبكر عندما كان يجري بدأ عملنا في هذا النظام (المرجع 13). نشكر جميع أعضاء المختبر Scholey. ويدعم عملنا على الانقسام في ذبابة الفاكهة المعاهد الوطنية للصحة منح GM55507.