تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام microinjection وعالية الدقة في التصوير<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em> الجنين المخلوي لدراسة الانقسام.
Abstract
يصف هذا البروتوكول استخدام الأجنة melanogaster ذبابة الفاكهة لدراسة الانقسام المخلوي 1. ذبابة الفاكهة والوراثة مفيدة مع تسلسل الجينوم ، ويمكن بسهولة أنها حافظت والتلاعب بها. وجود العديد من المسوخ الإنقسامية ، ومعربا عن الذباب المعدلة وراثيا وظيفية fluorescently (GFP مثلا) — البروتينات الإنقسامية الموسومة تم ويتم إنشاؤها حاليا. استهدفت التعبير الجيني هو ممكن باستخدام نظام GAL4/UAS 2.
الجنين في وقت مبكر ذبابة الفاكهة ينفذ mitoses متعددة بسرعة كبيرة (خلية مدة الدورة ، ≈ 10 دقيقة). وهو مناسب تماما عن الانقسام والتصوير ، لأنه خلال دورات 10-13 ، نواة الانقسام بسرعة وبشكل متزامن دون التدخل الحرائك الخلوية على سطح الجنين في أحادي الطبقة واحدة فقط تحت القشرة. هذه النوى تقسيم بسرعة على الأرجح استخدام الآلية الإنقسامية نفس الخلايا الأخرى ، ولكن ما هي الأمثل للسرعة ، ويعتقد عموما أن لا يكون نقطة تفتيش صارمة ، والسماح للدراسة البروتينات الإنقسامية الذي سيسبب عدم اعتقال خلية دورة في زنزانات مع نقطة تفتيش قوية . ويمكن التعبير عن البروتينات الأجنة GFP المسمى أو microinjected مع بروتينات fluorescently المسمى التقط بسهولة لمتابعة ديناميكية حية (الشكل 1). بالإضافة ، يمكن microinjected الأجنة مع وظيفة حجب الأضداد أو مثبطات لبروتينات محددة لدراسة تأثير فقدان أو اضطراب وظيفتها 3. يمكن لهذه الكواشف منتشر في جميع أنحاء جنين ، حيث بلغت مغزل لانتاج العديد من الانحدار تركيز مثبط ، والتي تؤدي بدورها في الانحدار من عيوب مماثلة لسلسلة أليلية من المسوخ. من الناحية المثالية ، إذا fluorescently المسمى البروتين المستهدفة ، ويمكن التدرج من تثبيط يمكن تصور مباشرة 4. فمن المفترض أن أقوى النمط الظاهري هو مشابه إلى النمط الظاهري فارغة ، على الرغم من أنه من الصعب استبعاد احتمال رسميا أن الأجسام المضادة قد تكون لها آثار المهيمنة في حالات نادرة ، والضوابط الصارمة وتفسير ذلك الحذر يجب أن يطبق. بعيدا عن موقع الحقن ، وظيفة البروتين هو فقط السماح فقدت جزئيا وظائف أخرى من البروتين المستهدف لتصبح واضحة.
Protocol
Discussion
هذا البروتوكول هو بسيط نسبيا ، ومع ذلك ، يتطلب ممارسة كل خطوة للتأكد من عدم تلف الأجنة. تجارب التحكم الدقيق دائما بحاجة إلى القيام به لضمان أن يتم الحصول على نتائج موثوقة. واحد وسيلة جيدة لبدء هذه هي microinjecting العازلة أو رودامين تويولين في التعبير عن السيطرة الأجنة GFP – ت…
Acknowledgements
ويجري حاليا استخدام هذا البروتوكول في مختبرنا وتم صقلها على مر السنين الكثير من الناس بمن فيهم الدكاترة ديفيد شارب ، كوون Mijung ، Sommi باتريسيا ، Cheerambathur Dhanya. نشكر الدكتور بيل سوليفان (UCSC) الذين قدموا لنا المشورة ممتازة على التلاعب وmicroinjection للأجنة ذبابة الفاكهة في وقت مبكر عندما كان يجري بدأ عملنا في هذا النظام (المرجع 13). نشكر جميع أعضاء المختبر Scholey. ويدعم عملنا على الانقسام في ذبابة الفاكهة المعاهد الوطنية للصحة منح GM55507.
References
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Mitotic spindle dynamics in Drosophila. Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Morris, R. L. Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos. Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).
- Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).
- Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).
- Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states. J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).
- Cheerambathur, D. K. Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient. J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).
- Kwon, M. The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility. Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).
- Sharp, D. J. Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).
- Sharp, D. J. The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles. J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).
- Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).
