Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale
Summary
Questo protocollo descrive l'uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione nel<em> Drosophila melanogaster</em> Embrione sinciziale per studiare la mitosi.
Abstract
Questo protocollo descrive l'uso di embrioni di Drosophila melanogaster sinciziale per lo studio mitosi 1. Drosophila è genetica utile con un genoma sequenziato, e può essere facilmente gestito e manipolato. Mutanti mitotici esistono molte, e vola transgenici che esprimono funzionale fluorescente (es. GFP) – proteine mitotico tag sono stati e vengono generati. Espressione genica mirata è possibile con il sistema GAL4/UAS 2.
L'embrione di Drosophila primi svolge mitosi multipli molto rapidamente (durata del ciclo cellulare, ≈ 10 min). E 'adatto per l'imaging mitosi, perché durante i cicli di 10-13, i nuclei si dividono rapidamente e in modo sincrono senza intervenire citocinesi sulla superficie dell'embrione in un monostrato singolo appena sotto la corteccia. Questi nuclei si dividono rapidamente probabilmente usare gli stessi macchinari mitotico come le altre cellule, ma sono ottimizzate per la velocità, il checkpoint è generalmente ritenuto di non essere rigorosi, permettendo lo studio delle proteine mitotico la cui assenza avrebbe causato l'arresto del ciclo cellulare in cellule con un posto di blocco forte . Gli embrioni che esprimono proteine GFP etichettati o microiniettati con le proteine fluorescente può essere facilmente ripreso a seguire le dinamiche vivere (Fig. 1). Inoltre, gli embrioni possono essere microiniettati con funzione di blocco anticorpi o inibitori di proteine specifiche per studiare l'effetto della perdita o di perturbazione della loro funzione 3. Questi reagenti possono diffondere in tutto l'embrione, raggiungendo molti fusi per produrre un gradiente di concentrazione di inibitore, che a sua volta in un gradiente di difetti paragonabile ad una serie alleliche di mutanti. Idealmente, se la proteina bersaglio è fluorescente, il gradiente di inibizione può essere direttamente visualizzato 4. Si presume che il più forte fenotipo è paragonabile al fenotipo nullo, anche se è difficile escludere formalmente la possibilità che gli anticorpi possono avere effetti dominante in rari casi, i controlli in modo rigoroso e cauta interpretazione deve essere applicata. Più lontano dal sito di iniezione, la funzione delle proteine è solo parzialmente perso permettendo altre funzioni della proteina bersaglio a diventare evidente.
Protocol
Discussion
Questo protocollo è relativamente semplice, tuttavia, ogni passo richiede pratica per assicurarsi che gli embrioni non siano danneggiati. Esperimenti di controllo attento sempre bisogno di essere fatto per garantire che i risultati affidabili si stanno ottenendo. Un buon modo per cominciare questo è microinjecting tubulina buffer o rodamina in embrioni di controllo che esprime GFP-tubulina per assicurarsi che la mitosi procede normalmente attraverso tutti i cicli in superficie dell'embrione (cicli da 10 a 13). Neg…
Acknowledgements
Questo protocollo è attualmente utilizzato nel nostro laboratorio ed è stato affinato negli anni da molte persone tra dottori David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur. Ringraziamo il dottor Bill Sullivan (UCSC), che ci ha fornito ottimi consigli sulla manipolazione e la microiniezione di primi embrioni di Drosophila quando il nostro lavoro in questo sistema era in fase di avvio (rif. 13). Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Scholey. Il nostro lavoro sulla mitosi in Drosophila è sostenuto da NIH concedere GM55507.
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