Этот протокол описывает использование микроинъекции и высоким разрешением в<em> Дрозофилы</em> Синцитиального эмбриона для изучения митоза.
Этот протокол описывает использование дрозофилы синцитиального эмбриона для изучения митоза 1. Дрозофилы имеет полезную генетики с геном последовательность, и ее можно легко сохранять и манипулировать. Многие мутанты митотической существует, и трансгенных мух выражения функциональных флуоресцентно (например, GFP) – меченый белков митотического были и в настоящее время генерируется. Целевые экспрессии генов можно с помощью системы GAL4/UAS 2.
Дрозофилы раннего эмбриона проводит несколько митозов очень быстро (клеточного цикла продолжительность, ≈ 10 мин). Она хорошо подходит для работы с изображениями митоз, потому что во время циклов 10-13, ядра делятся быстро и синхронно, не вмешиваясь цитокинеза на поверхности эмбриона в одном монослое только под корой. Эти быстро делящихся ядер, вероятно, использовать те же механизмы митотического как и другие клетки, но они оптимизированы для скорости; контрольно-пропускного пункта, как правило, считается не строгим, позволяя изучение митотических белков, отсутствие которых может вызвать остановку клеточного цикла в клетках с сильным контрольно-пропускной пункт . Эмбрионы выражения GFP меченых белков или microinjected с флуоресцентно меченые белки могут быть легко отображаемого следовать жить динамики (рис. 1). Кроме того, эмбрионы могут быть microinjected с функцией блокировки антителами или ингибиторами специфических белков для изучения влияния потери или возмущении их функции 3. Эти реагенты могут диффундировать по всему эмбриона, достигнув многих шпинделей для получения градиента концентрации ингибитора, который, в свою очередь приводит к градиенту дефектов сравнимы с аллельных серий мутантов. В идеале, если целевой белок флуоресцентно меченных, градиент торможение может быть непосредственно визуализировать 4. Предполагается, что сильнейшие фенотип можно сравнить с нулевой фенотип, хотя трудно формально исключает возможность того, что антитела могут иметь доминирующую эффектов в редких случаях, так что строгий контроль и осторожная интерпретация должна быть применена. Подальше от укола, функции белка лишь частично потерял позволяющий другие функции белка-мишени, чтобы стать очевидным.
Этот протокол является относительно простым, тем не менее, каждый шаг требует практики, чтобы убедиться, эмбрионы не повреждены. Тщательные контрольные эксперименты всегда нужно сделать для того, что надежные результаты получаются. Один хороший способ начать это путем microinjecting буфера ?…
Этот протокол используется в настоящее время в нашей лаборатории и был усовершенствован в течение ряда лет многие люди, включая доктора Дэвида Шарпа, Mijung Квон, Патриция Sommi, Dhanya Cheerambathur. Мы благодарим Д-р Билл Салливан (УСК), который предоставил нам отличный совет на манипуляции и микроинъекции ранних эмбрионов дрозофилы, когда наша работа в этой системе в настоящее время начато (см. 13). Мы благодарим всех членов лаборатории Шоли. Наша работа на митоз у дрозофилы при поддержке гранта NIH GM55507.