Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Historische Ansicht und Physiologie Demonstration am NMJ der Crayfish Opener Muscle

doi: 10.3791/1595 Published: November 9, 2009

Summary

Der Opener Muskeln des Krebses Bein ist bekannt für seine historische Bedeutung und experimentelle Vielseitigkeit in Muskel-Phänotyp, synaptischen Physiologie und Plastizität vorgestellt.

Abstract

Hier präsentieren wir einige der wichtigsten wichtige Entdeckungen mit dem Opener neuromuskulären (NMJ) Vorbereitung von Krebstieren hergestellt und zeigen, dass es noch viel von diesem Modell Vorbereitung zu lernen. In das Verständnis der Geschichte kann man verstehen, warum auch heute noch dieses NMJ bietet immer noch ein reiches Betätigungsfeld, um Fragen zu Pre-und Post-synaptischen Funktion und Plastizität Adresse. Die Lebensfähigkeit und einen leichten Zugang zum Terminal für die intrazelluläre als auch extrazelluläre Elektrophysiologie und Bildgebung erhebliche Vorteile. Die Mechanismen, die hinter der Modulation der vesikulären Kinetik und Fusion in der High-und Low-Output-Terminals sind für die Untersuchung Betteln. Die Vorbereitung bietet auch eine überprüfbare Modellsystem für Computational Einschätzungen und Manipulationen an wichtigen Variablen in theoretischen Modellen der synaptischen Funktion zu untersuchen, zum Beispiel Calcium-Dynamik während der kurzzeitigen Erleichterung. Die synaptischen Komplexität der aktiven Zone und der statistischen Natur des quantal Version ist auch eine offene Umgebung für zukünftige Untersuchungen sowohl experimentell als auch rechnerisch.

Protocol

Einführung

Die neuromuskulären Synapsen von Krebstieren haben wichtige Beiträge zur Physiologie und besonders synaptischen Physiologie im Laufe der Jahre zur Verfügung gestellt. Die Leichtigkeit in Dissektion und Lebensfähigkeit sind wohl die wichtigsten Faktoren, die frühen Anatom und Physiologe später an Krebs als experimentelle Präparate verwenden gefördert. Crayfish insbesondere sind leicht erhältlich von den meisten Süßwasser Flüsse und Seen, so gut sie können leicht in einem Labor zu erhalten als für Krebstiere, die eine kalte, Salzwasser-Umgebung verglichen.

Ein Zoologe zurück in den späten 1800 zu Herzen nahm, insbesondere Krebs Arten (dh, Krebse) und schrieb ein Buch mit dem Titel The Crayfish ( TH Huxley , 1879). Dieser Text diente als Führer auf diese Organismen seit Jahren und ist heute immer noch als ein umfassendes Buch selektiv auf Krebse Umgang mit Lebensgeschichte, Anatomie und Physiologie gefeiert. Huxley betrachtet die Krebse als Modell Tier in die Tiefen der Zoologie in allen Aspekten tauchen; damit den umfassenden Charakter des Buches. Der Zeitpunkt war günstig wie Physiologie in den späten 1880er Jahren mit Ringer-Verständnis der Ionen für die Aufrechterhaltung Froschherzen Zubereitungen (Ringer, 1882a, b) erforderlich blühenden war. Dies ist wahrscheinlich ein Grund, dass physiologische Experimente schnell voran in anderen Spezies als auch die Krebse. Außerdem hatte eine Kochsalzlösung zu Krustentier Präparate erhalten, indem van Harreveld wurde im Jahre 1936 beschrieben.

Überraschenderweise ist die Innervation der Opener Muskel Krebse Beinen war auch um diese Zeit in der Geschichte (Biedermann, 1887) geprägt. Aber noch überraschender ist, dass physiologische Studien, die bereits unterwegs waren in den Muskeln des Krebses von Charles Richet in Frankreich. In der Tat könnte die Experimente in Flusskrebse möglicherweise die erste Erleichterung an der neuromuskulären (NMJ) (siehe auch Richet, 1881 Richet, 1879) zu demonstrieren. Im Laufe der nächsten Jahrzehnte Krebse NMJs wurden anatomisch und physiologisch in Bezug auf Spannung Entwicklung und Anatomie (Van Harreveld und Wiersma, 1936) beschrieben.

Das Aufkommen der intrazellulären Aufnahme mit scharfen Elektroden (Ling und Gerard, 1949), revitalisiert das Feld, um verschiedene Arten von Fragen zu beantworten. Krustentier Muskeln waren bekannt, abgestufte Kontraktionen zu produzieren (Katz & Kuffler 1946; Katz, 1949; Wiersma, 1949), aber es war nicht bis 1953, dass Fatt und Katz Transmembranpotentiale der kurzfristigen Erleichterung in Krabben Muskelfasern erfasst.

Der Opener Muskeln in den Gliedmaßen von Krebsen war wieder im Jahr 1961 hervorgehoben, wenn Dudel und Kuffler gezeigt Erleichterung in diesem Muskel und zeigte für das 1. Mal das Phänomen der präsynaptischen Inhibition (1961a, b; Dudel, 1963, 1965a). Sie berichtete auch über die quantal Natur der synaptischen Transmission an diesem NMJ (1961b). In den letzten 50 Jahren hat es einiges an Aufmerksamkeit für die Vorbereitung und verschiedene Techniken verwendet werden, um synaptischen Physiologie Monitor worden. Für einen kurzen Überblick über Untersuchungen mit dieser Zubereitung wir uns mit der Feststellung, dass der gesamte Muskel durch eine erregende und eine hemmende Axon, die selektiv stimuliert werden könnte innerviert starten. Atwood (1964) gezeigt, mit den Zügen der Stimulation der exzitatorischen postsynaptischen Potentiale erleichtert und Muskelverspannungen produziert. Iravani (1965) berichteten über die regionalen Unterschiede in der synaptischen Antworten je nach Region des Muskels. Bald darauf Dudel (1965a, b) Potenziale entlang der Nervenendigungen auf dem Opener aufgenommen und gezeigt, dass die Neuromodulator Serotonin verbessert die synaptische Übertragung durch die Erhöhung quantal Inhalte bedeuten.

Zu dieser Zeit wurde festgestellt, dass Krebs Muskeln zu Glutamat und verschiedene Aminosäuren sowie GABA reagiert (Van Harreveld und Mendelson, 1959; Robbins, 1959;. Kerkut et al, 1965). Die hemmende Reaktionen der GABA wurde von Florey (Bazemore et al., 1956, 1957) und andere (Boistel und Fatt, 1958) identifiziert. Später GABA wurde isoliert und bestätigt durch Kravtiz (Kravitz und Potter, 1965; Kravitz et al, 1963a, b;. Kravitz, 1962) aus der Axone von Hummer Opener Vorbereitungen.

Die Krebse Muskeln bot nicht nur leicht zugänglich Vorbereitungen, sondern erlaubt es, zu untersuchen, wie einzelne identifizierbare Motoneuronen können in verschiedenen postsynaptischen Antworten auf physiologischer und struktureller Ebene führen. Insbesondere der Opener Muskel wird durch einen einzigen exzitatorischen Motoneuronen innerviert, aber die exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSPs) auf unterschiedlichen Standorten können über 50-fach in dorsalen oberflächlichen Fasern (Bittner, 1968a, b) variieren und so viel wie 8-fach in ventralen oberflächlichen Fasern (Iravani, 1965).

"> Mit dem bahnbrechenden entdecken, dass der Opener NMJ in Flusskrebse langfristige Erleichterung (LTF) (Sherman und Atwood, 1971) ausgestellt, neben kurzfristigen Erleichterung, die mechanistischen Grundlagen für diese Phänomene erforderlich, um zu richten. Als Nebeneffekt beachten Sie, Langzeit-Potenzierung (LTP) wurde im Gehirn der Wirbeltiere zwei Jahre später (Bliss und L mo, 1973) ohne Nennung der ursprünglichen Entdeckung des Phänomens auf die Krebse NMJ entdeckt. Seit dieser Zeit viele Forscher auf die Attribute konzentriert von STF und LTF mit dem Opener NMJ von Krebsen, die zellulären Mechanismen (Atwood, 1973, 1976, 1982 zu studieren; Atwood et al, 1994;. Zucker, 1973, 1974a, b; Bittner und Sewell, 1976;. Parnas et al, 1982a, b, c, d; Dudel et al, 1983;.. Vyshedskiy und Lin, 1997a, b, c) Auch ein Fokuspunkt wurde, zu verstehen, wie ein einzelner Motoneuronen innervieren verschiedene Muskelfasern auf dem Opener Muskel kann Anlass geben zu so unterschiedlichen synaptischen Antworten (Linder, 1974; G ° nzel et al, 1993;. Govind et al, 1994;. Iravani, 1965; Atwood, 1967; Bittner, 1968a, b; Sherman und Atwood, 1972; Zucker, 1974a; Parnas et al, 1982a;. Zucker und Haydon, 1988; Dudel, 1989a, b, c, d).

Synaptic Struktur zu berücksichtigen für die differentielle synaptischen Antworten können über ultrastrukturelle Analyse (Jahromi und Atwood, 1974) untersucht werden. Maßnahmen von ionischen Unterschiede aufgrund der Aktivität der Lage ist, mit axonalen Injektionen von Ca2 + und Na +-Indikatoren sowie Ca2 +-Puffer (Mulkey und Zucker 1993.; Winslow et al, 2002) untersucht werden, und diese Flüsse können im Terminal modelliert werden (Winslow et al, 1994;. Cooper et al, 1996b).. Aktivität abhängig Anpassungen (Atwood et al, 1991.) Und die pharmakologische Identifizierung Neuromodulator-Rezeptor-Subtypen (Dropic et al, 2005;. Ruffner et al, 1999;. Sparks und Cooper, 2004; Sparks et al, 2004;. Tabor und Cooper , 2002;), die synaptischen Vesikel-Pools und Kinetik (Logsdon et al, 2005 beeinflussen;. Southard et al, 2000;.. Sparks et al, 2003) wurde ebenfalls untersucht, das den Weg zu neuen Fragen angesprochen werden. Die Konzepte von Kalzium Rolle bei STF gegenüber Membrandepolarisation in synaptischen Übertragung an der Opener NMJ einige Meinungsverschiedenheiten (; Hochner et al, 1989 Mulkey und Zucker, 1991) führen.

Vor relativ kurzer Zeit die regionale Differenzierung der synaptischen Stärke und Erleichterung aus dem einzigen Motor Neuron, wurde angesprochen und erscheint aufgrund der Unterschiede der lokalen präsynaptischen Veränderungen der synaptischen Struktur und Physiologie (Atwood et al, 1994;. Atwood und Cooper, 1995, 1996a , b; Cooper et al, 1995b, 1996a, b).. Ultrastrukturelle Analyse von elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Krampfadern der Mehrheit der synaptischen Kontakte (Florey und Cahill, 1982.; Cooper et al, 1995b) enthalten. Die Stärke der synaptischen Übertragung nimmt entlang der Länge einer einzelnen Klemme, die werden aufgrund der Komplexität der synaptischen Struktur (Cooper et al, 1996a..; Govind et al, 1994) erscheint. Die Unterschiede in den synaptischen Struktur erklärt vielleicht zum Teil die Unterschiede in der Ca2 +-Einstrom während der Stimulation bei verschiedenen Frequenzen (Cooper et al., 1995b, 1996b).

Da es regionale Unterschiede in der Muskel-Phänotyp und Biochemie unter den Muskelfasern des Openers (.. G ° nzel, et al, 1993; Mykles et al, 2002) sind die in Regionen geteilt sind, könnte erklären, ein entwicklungsregulierten Muskel Phänotyp, Einflüsse und pflegt die regionalen Unterschiede der motorischen Neurons (Mykles et al., 2002). Die Idee der retrograden Einflüsse hat in Frosch Skelettmuskel (Nudell und Grinnell, 1983) untersucht worden, in dem Hummer (Katz et al., 1993), und in Krebsen (Lnenicka und Mellon, 1983) mit hinreichender überzeugende Beweise. Die lokale Regulation der Terminals in einem einzigen Neuron, ohne Einfluss auf andere Terminals ist räumlich gut möglich, in Krustentier Motoneuronen, weil die Terminals können von 1cm bis 10cm in Distanz zu messen voneinander. Im Gegensatz zu Wirbeltieren, kann ein Motor-Einheit gehören mehr als ein Muskel in wirbellosen Tieren (siehe Ubersicht von Atwood, 1973). Der Erreger Motoneuronen, dass die gesamte Opener innerviert auch innerviert die Bahre Muskel in eine proximale Bein-Segment. Facilitation Messungen zwischen Muskelfasern des Openers Muskel zeigte, dass es Unterschiede gibt, die Ruhestätte Ebenen in Ca2 in Zusammenhang stehen können +-Ionen (Cooper et al., 2005b) und / oder möglicherweise kooperativ der Freigabe (Parnas et al., 1982a, b)

Die Unterschiede in strukturellen Komplexität bei den High-und Low-Output-Synapsen entlang der Terminals auf dem Opener Muskel wurden quantal Unterschriften in Bezug auf Rekrutierung von akti untersuchtve Zonen unter Synapsen während STF aber das hat sich als schwer zu ermitteln (Lancaster et al, 2007;. VIELE et al, 2003, 2006.). Mögliche Pools von Vesikeln zwischen High-und Low-Output-Synapsen wird sich unterschiedlich in der Kinetik geregelt werden, wie es ist bekannt neromodulators haben unterschiedliche Auswirkungen auf Low-und High-Output-Terminals (Logsdon et al, 2005;. Sparks und Cooper, 2004; Cooper et al., 2003).

Die künftige Nutzung des Openers Muskel-Präparat in Flusskrebs ist so reich wie vor 50 oder vor 100 Jahren gewesen ist. Die Zubereitung ist nach wie vor sehr robust im Vergleich zu vielen anderen synaptischen Vorbereitungen. Quantal Reaktionen können elektrophysiologische direkt an die synaptischen Kontakte aufgenommen als auch für Vesikel Dynamik in verschiedenen Arten von gut definierten Terminals abgebildet. Die Zubereitung wurde nicht seinen Charme in mit einzelnen identifizierbaren Neuronen für die erregenden und hemmenden Eingänge verloren. Trotz der Krebse nicht zur genetischen Manipulation praktisch, sind Studien möglich, die Rolle des synaptischen Proteinen wie Drosophila-Adresse. Es gibt viele Ähnlichkeiten in der synaptischen Funktion Drosophila NMJs (Atwood und Cooper, 1995, 1996a, b), dass durch Protein-Injektion Studien untersucht werden (He et al., 1999) kann. Die Regulierung der synaptischen Vesikel-Pools innerhalb motorischen Nerven-Terminals ist auch eine reiche Gebiet für zukünftige Untersuchungen sowie mechanistische Studien an Kalzium-Regulation während der STF (Desai-Shah et al, 2008.; Desai-Shah und Cooper, 2009) zu verstehen, um viele zu erklären der restlichen Geheimnisse in die Grundlagen der synaptischen Übertragung.

Methoden

Zergliederung

Crayfish, Procambarus clarkii, Mess 6-10 cm Körperlänge (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA) induziert werden, um den ersten oder zweiten Fuß Bein kräftig kneifen am ischiopodite Segment zu automatisieren.

Abbildung 1
Schalten Sie das Bein herum, bis man sicher sein, nach außen (lateral) Seite nach oben auf die Zerlegung Platte. Dies ist normalerweise der gewölbten Seite nach oben. Aufstellen des Beins auf einem Stück Toilettenpapier hilft so die Zubereitung leicht gedreht werden kann, während machen diese Kürzungen.

Abbildung 2

Mit einem Skalpell Leistungsschalter und Inhaber einer scharfen Rasierklinge wird zum Ätzen der Nagelhaut bis kurz Durchtrennen des Musters in diese Zahl für die meropodite Segment ausgewiesen werden. Pflege muss verwendet werden, nicht zu weit distal auf der dorsal nach ventral cut von der meropodite werden - carpopodite Gelenk. Verlassen Sie die Nagelhaut statt für jetzt.

Abbildung 3

Abbildung 4

Mit dem Rasiermesser Skalpell etch die Schuppenschicht auf der propodite bis kurz Durchtrennen in das Muster in Abbildung oben für die propodite Segment auf einer Seite dargestellt und wiederholen Sie dann auf der anderen Seite Verbinden des proximalen Schnitten. Pflege muss verwendet werden, nicht in dem Opener Muskel geschnitten werden. Dies kann, indem sie die Klinge gelehnt in die nähere Muskel beim Schneiden durch die Kutikula durchgeführt werden. Auch für die dorsal nach ventral geschnitten, Anschluss rund um die Bauchseite, darauf achten, nicht geschnitten zu proximal als gemeinsame Verbindung schmal und leicht gebrochen ist. Verlassen Sie die Nagelhaut statt für jetzt.

Abbildung 5

Die Vorbereitungen sollten in Kochsalzlösung gelegt werden. Diese Zerlegung Gericht sollte eine Sylgard (Dow Corning)-Beschichtung auf der Unterseite (1 cm dick). Die Sylgard so verwendet wird, das Insekt Stifte in kann für die Abhaltung der Vorbereitung noch beklebt werden. An dieser Stelle halten einen Stift in der dorsalen kaudalen Ecke, in der Schnitt, der das Fenster in der meropodite gemacht.
Mit feinen Pinzette (# 5) leicht anheben der Kutikula vom distalen Ende und mit dem Rasiermesser, schnitt die flexor Muskelfasern vom Nagelhaut, Schneiden in einer distal nach proximal Weise. Heben Sie das Fenster der Oberhaut aus.

Abbildung 6

Abbildung 7

Schneiden Sie nun die apodeme (Sehne) am meropodite - carpopodite Gelenk (siehe unten). Seien Sie sehr vorsichtig, um die Sehne ziehen weg von dem Bein Hohlraum, bevor der zu reduzieren und nur schneiden die Sehne und nicht den Hauptlauf Nerv, der auf der Innenseite der Sehne ist. Pinch der Sehne, wo sie mit einer Pinzette geschnitten wurde, und ziehen Sie die Beugemuskeln durch Anheben in kaudal. Jetzt Hauptlauf Nerven und die Extensoren ausgesetzt sind.

Abbildung 8

Fahren Sie mit dem propodite Segment und jetzt an der propodite dactylop geschnittenodite Gelenk. Hier die nähere Sehne vielleicht aus der Kutikula Anlage geschnitten. Ziehen Sie den Bauch (näher Muskel auf dieser Seite) Segment der propodite nach unten und hinten nach kaudal, so dass der Muskel in der kaudalen Region verbunden gesehen werden kann. Cut diese Muskeln mit dem Rasiermesser. Achten Sie darauf, um den Muskel zu schneiden in der Nähe des Gelenks und Risiko Schneiden der motorischen Nerven Zweig der Opener Muskel. Der Opener Muskel ist jetzt die Salzlösung ausgesetzt.

Abbildung 9

Abbildung 10

Zurück zur meropodite Region, um die Nervenbündel mit dem erregenden und hemmenden motorischen Neuronen der Opener Muskel zu isolieren. In den meisten kaudalen Bereich des meropodite Segment des Beines Nervenbündel enthält in der Regel ein separates Nervenbündel. Diese kurze Region, in der zwei Bündel gesehen werden kann, ist, wo die dorsale Bündel mit einer feinen Schere durchtrennt werden können. Das abgeschnittene Ende kann dann mit # 5 Pinzette aufgenommen und vorsichtig nach distal bis etwa die Hälfte der Länge des meropodite Segment erreicht wird gezogen. Diese lange Nervenast enthält die erregenden Auftakt Nerven und den größeren Nervenbündel enthält die hemmende Motoneuronen des Openers Muskel.

Abbildung 11

Abbildung 12

Abbildung 13

Die Vorbereitung in der meropodite Segment ist nun in einer diagonalen, derart, dass ein Insekt Stift durch die Dorsalseite des meropodite platziert werden abgeschnitten. Diese Positionen der ventralen Seite des Openers Muskel so einrichten, dass es dem Betrachter zugewandten (siehe unten).

Abbildung 14

Abbildung 15

Abbildung 16

Die restlichen Fasern des näher Muskel, der den Blick auf den Opener Muskel nun, indem die Fasern gegen die Schuppenschicht und aus dem propodite Hohlraum entfernt werden kann. Manchmal ist ein Bindegewebe deckt der Opener, die vorsichtig mit der Nr. 5 Pinzette entfernt werden können. Der Hauptlauf Nerven, die entlang der Opener Muskel läuft und geht in den dactylopodite kann entweder gekürzt werden, zu Beginn des dactylopodite gemeinsame oder einfach hochgezogen mit dem feinen Pinzette. Dieser Hauptlauf Nerven und manchmal auch die Hand verbunden Blutgefäß kann nun vorsichtig in eine proximale Richtung gezogen werden für die Dauer des Openers Muskel und dann weggeschnitten.

Abbildung 18

Jetzt der Opener Muskel ist ohne Gewebe im Wege einer intrazellulären Elektrode oder ein Schwerpunkt macropatch Elektrode bekommen ausgesetzt.

Abbildung 19

Um die erregenden Nerv zum Muskel zu stimulieren Opener der Vorbereitung ist es nun, eine Aufnahme Kammer mit einer Kunststoff-Saug-Elektrode ausgebildet verschoben. Nachdem der stimulierenden Elektrode in die Kammer gebaut wird vermieden, dass zu einem Mikromanipulator verwenden, um einen stimulierenden Elektrode statt. Pin der Vorbereitung in der Aufnahme Schüssel und platzieren Sie den Zweig der Nerv, der die erregenden Nerv in der Saug-Elektrode enthält.

Abbildung 20

Abbildung 21

(Entnommen aus: Mykles, DL, Medler, SA, Koenders, A., und Cooper, ist RL (2002) Myofibrilläre Protein-Isoform-Expression mit synaptischen Effektivität in langsame Fasern der Klaue und Bein Opener Muskeln Langusten und Hummer korreliert Journal of. Experimental Biology 205 (4): 513-522).

Saline

(:, 5,3 KCl, 13,5 CaCl2.2H2O; 2,45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES auf pH 7,4 205 NaCl in mM) seziert Vorbereitungen sind in Flusskrebse Kochsalzlösung, einem modifizierten Van Harreveld-Lösung erhalten.

Recording intrazellulären EPSPs

Um zu entlocken eines evozierten Reaktion ist die exzitatorischen Axon selektiv durch ein Grass-Stimulator stimuliert. Eine Region der Opener Muskel ist mit scharfen intrazellulären Elektrode (20 bis 30 mOhm Widerstand) mit 3 M KCl gefüllt aufgespießt. Ein Standard Kopf Bühne und Verstärker für die intrazelluläre Aufnahme kann verwendet werden, allerdings benutzten wir ein Modell Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) Verstärker und 1 X LU Kopf der Bühne. Kurzfristige Erleichterung (STF) oder verschiedene andere Art von Antworten gewünscht kann durch Variation der Reiz Bedingungen erhalten werden. STF ist, indem er einen Zug von 10 oder 20 Impulsen bei 10 oder 20 Sekunden-Intervallen jeweils die exzitatorischen Nervenzellen erhalten. Die Frequenz der Stimulation innerhalb des Zuges kann variiert (40, 60 und 80 Hz) werden. Intrazellulären EPSP Aufnahmen werden regelmäßig von diesen Standard-Verfahren durchgeführt (Crider & Cooper, 1999, 2000;. Cooper et al 1995b; Dudel, 1983; Sparks und Cooper, 2004; Desai-Shah und Cooper, 2009).

Distal, zentralen und proximalen: Der Opener Muskel ist in drei allgemeine Bereiche unterteilt. Auch wenn der gesamte offene Muskel durch einen einzigen Motor Neuron innerviert wird, werden die NMJs strukturell verschieden und haben die regionalen Unterschiede in der synaptischen Wirksamkeit in diesen drei allgemeine Bereiche (Cooper et al. 1995a, b). Die Muskelfaser Phänotyp-Typ wurde auch gezeigt, dass in diesen Regionen unterschiedlich (Mykles et al. 2002). Aus diesen Gründen sind die distalen Fasern verwendet, da sie leicht für Konsistenz zwischen Vorbereitungen abgegrenzt sind.

Abbildung 22

Recording Schwerpunkt quantal EPSPs direkt über identifizierbare Regionen der Nervenendigung

Die synaptischen Krampfadern werden visualisiert mit den vitalen Farbstoff 4-Di-2-Asp (Magrassi et al., 1987), die keine Auswirkungen auf die synaptische Übertragung, bei den verwendeten Konzentrationen und Zeiten beschäftigt (5 uM, 5-min-Behandlung, Cooper et al ., 1995b). Mit Fluoreszenzmikroskopie, das Lumen eines Makro-patch Aufnahme-Elektrode (Cooper et al, 1995c;.. Stübe Böhmer et al, 1983) konnte direkt über einen einzelnen, isolierten Krampfadern platziert werden. Zum Aufrufen der Nervenendigung, die exzitatorischen motorischen Nerven stimuliert, wie oben erwähnt. Spontane sowie evozierte quantal Antworten können entlang der Kette von visualisiert Krampfadern aufgezeichnet werden, indem Sie vorsichtig Senkung der Lumen und erhöhen sie über jeden Krampfadern.

Wojtowicz et al; Die synaptischen Potentiale werden durch ein Makro-Patch-Elektrode im Wesentlichen wie von Dudel, 1981 beschrieben aufgezeichnet. (1991) und Mallart (1993). Kimax Glas (Außendurchmesser: 1,5 mm) gezogen wurde und Feuer-poliert, um Patch-Tipps mit Innen-Durchmessern von 10 bis 20 um hergestellt. Das Lumen der Elektrode ist mit dem Bade Medium gefüllt ist. Der Verstärker ist die gleiche wie die für die intrazelluläre Aufnahme oben genannten verwendet. Elektrode und Dichtung Widerstand kann durch das Bestehen der Prüfung Stromimpulse durch die Elektrode bestimmt werden. Seal Widerstände reichten von 0,3 bis 1,0 M0hm und die Elektrode Widerstand reichte von 0,5 bis 1,0 M.0. Seal Widerstand kann während der Aufnahme kontrolliert werden.

Direkte Zählung der quantal Ereignisse mit geringer Stimulation Frequenzen möglich. Für jede evozierte, kann die Anzahl der quantal Ereignisse bestimmt werden. Für eine Reihe von Reaktionen, die Gesamtzahl der quantal Ereignisse gezählt, um dann Schätzung bedeuten quantal Inhalte auf diesen direkten Zählungen basieren. Ein Ansatz zur Berechnung bedeuten quantal Inhalt ist unter der Gesamtzahl der Quanten und teilen sie durch die Gesamtzahl der Antworten (del Castillo und Katz, 1954). Es gibt auch andere Ansätze kann man verwenden als auch auf die Amplitude oder die Fläche des EPSPs (Cooper et al., 1995b) basiert.

References

  1. Atwood, H. L. γ -aminobutyric acid and crab muscle fibres. Experientia (Basel). 20, 161-163 (1964).
  2. Atwood, H. L. Variation in physiological properties of crustacean motor synapses. Nature. 215, 58-58 (1967).
  3. Atwood, H. L. An attempt to account for the diversity of crustacean muscles. Am. Zool. 13, 357-378 (1973).
  4. Atwood, H. L. Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems. Prog. Neurobiol. 7, 291-391 Forthcoming.
  5. Atwood, H. L. Synapses and neurotransmitters. The Biology of Crustacea. Sandeman, H. L., Atwood, D. C. 3, Academic Press, Inc. New York. 105-150 (1982).
  6. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Functional and structural parallels in crustaceans and Drosophila neuromuscular systems. Am. Zool. 35, 556-565 (1995).
  7. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Assessing ultrastructure of crustacean and insect neuromuscular junctions. J. Neurosci. Meth. 69, 58-58 (1996).
  8. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions. Invertebrate Neurosci. 1, 291-307 (1996).
  9. Atwood, H. L., Cooper, R. L., Wojtowicz, J. M. Non-uniformity and plasticity of quantal release at crustacean motor nerve terminals. Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research. Molecular and Cellular Mechanisms of Neurotransmitter Release. Stjärne, L., Greengard, P., Grillner, S. E., Hökfelt, T. G. M., Ottoson, D. R. Raven Press. New York. 363-382 (1994).
  10. Atwood, H. L., Nguyen, P. V., Mercier, A. J. Activity-dependent adaptation in neuromuscular systems: comparative observations. Plasticity of Motoneural Connections. Elsevier. 101-114 (1991).
  11. Bazemore, A., Elliott, K. A. C., Florey, E. Factor I and γ -aminobutyric acid. Nature. 178, 1052-1053 (1956).
  12. Bazemore, A. W., Elliott, K. A. C., Florey, E. Isolation of Factor I. J. Neurochem. 1, 334-339 (1957).
  13. Biedermann, W. Beiträge zur allgemeinen Nerven- und Muskelphysiologie. Zwanzigste Mittheilung. über die Innervation der Krebsschere. Sitz. Berlin D. Akad. Wiss. Wien, Math. Naturwiss. Kl. Abt. III. 95, 7-40 (1887).
  14. Bittner, G. D. Differentiation of nerve terminals in the crayfish opener muscle and its functional significance. J. Gen. Physiol. 51, 731-758 (1968).
  15. Bittner, G. D. The differentiation of crayfish muscle fibers during development. J. Exp. Zool. 167, 439-456 (1968).
  16. Bittner, G. D., Sewell, V. L. Facilitation at crayfish neuromuscular junctions. J. Comp. Neurol. 109, 287-308 (1976).
  17. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 357-374 (1973).
  18. Boistel, J., Fatt, P. Membrane permeability change during inhibitory transmitter action in crustacean muscle. J. Physiol. 144, 176-191 (1958).
  19. Cooper, R. L., Dönmezer, A., Shearer, J. Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target. Neuroscience Research. 45, 163-172 (2003).
  20. Cooper, R. L., Hampson, D., Atwood, H. L. Synaptotagmin like expression in the motor nerve terminals of crayfish. Brain Res. 703, 214-216 (1995).
  21. Cooper, R. L., Harrington, C. C., Marin, L., Atwood, H. L. Quantal release at visualized terminals of a crayfish motor axon: Intraterminal and regional differences. J. Comp. Neurol. 375, 583-600 (1996).
  22. Cooper, R. L., Marin, L., Atwood, H. L. Synaptic differentiation of a single motor neuron: Conjoint definition of transmitter release, presynaptic calcium signals and ultrastructure. J. Neurosci. 15, 4209-4222 (1995).
  23. Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions and rat hippocampus. J. Neurosci. Meth. 61, 67-79 (1995).
  24. Cooper, R. L., Winslow, J., Govind, C. K., Atwood, H. L. Synaptic structural complexity as a factor enhancing probability of calcium mediated transmitter release. J. Neurophysiol. 75, 2451-2466 (1996).
  25. Crider, M. E., Cooper, R. L. The importance of the stimulation paradigm in determining facilitation and effects of neuromodulation. Brain Research. 842, 324-331 (1999).
  26. Crider, M. E., Cooper, R. L. Differentially facilitation of high- and low-output nerve terminals from a single motor neuron. J. of Applied Physiology. 88, 987-996 (2000).
  27. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. J. Physiol. (Lond). 124, 573-57 (1954).
  28. Desai-Shah, M., Cooper, R. L. Different mechanisms of Ca2+ regulation that influence synaptic transmission: comparison between Crayfish and Drosophila NMJs. SYNAPSE. In Press (2009).
  29. Desai-Shah, M., Viele, K., Sparks, G., Nadolski, J., Hayden, B., Srinivasan, V. K., Cooper, R. L. Assessment of synaptic function during short-term facilitation in motor nerve terminals in the crayfish. Open Neurosci. J. 2, 24-35 (2008).
  30. Dropic, A. J., Brailoiu, E., Cooper, R. L. Presynaptic mechanism of action induced by 5-HT in nerve terminals: Possible involvement of ryanodine and IP3 sensitive Ca2+ stores. Comp. Biochem. Phys. A. 142, 355-361 (2005).
  31. Dudel, J. Presynaptic inhibition of the excitatory nerve terminal in the neuromuscular junction of the crayfish. Pflügers Arch. ges. Physiol. 277, 537-557 (1963).
  32. Dudel, J. The mechanism of presynaptic inhibition at the crayfish neuromuscular junction. Pflügers Arch. 284, 66-80 (1965).
  33. Dudel, J. Potential changes in the crayfish motor nerve terminal during repetitive stimulation. Pflügers Arch. 282, 323-337 (1965).
  34. Dudel, J. Graded or all-or-nothing release of transmitter quanta by local depolarization of nerve terminals on crayfish muscle. Pflügers Arch. 398, 155-164 (1983).
  35. Dudel, J. Calcium dependence of quantal release triggered by graded depolarization pulses to nerve terminals on crayfish and frog muscle. Pflügers Arch. 415, 289-298 (1989).
  36. Dudel, J. Shifts in the voltage dependence of synaptic release due to changes in the extracellular calcium concentration at nerve terminals on muscle of crayfish and frogs. Pflügers Arch. 415, 299-303 (1989).
  37. Dudel, J. Calcium and depolarization dependence of twin-pulse facilitation of synaptic release at nerve terminal of crayfish and frog muscle. Pflügers Arch. 415, 304-309 (1989).
  38. Dudel, J. Twin pulse facilitation in dependence on pulse duration and calcium concentration at motor nerve terminals of crayfish and frog. Pflügers Arch. 415, 310-315 (1989).
  39. Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflügers Arch. 391, 35-40 (1981).
  40. Dudel, J., Franke, C., Hatt, H. Rapid activation and desensitization of transmitter-liganded receptor channels by pulses of agonists. Ion Channels. Narahashi, T. 3, Plenum Press. New York. 207-260 (1992).
  41. Dudel, J., Kuffler, S. W. The quantal nature of transmission and spontaneous miniature potentials at the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (Lond). 155, 529-52 (1961).
  42. Dudel, J., Parnas, I., Parnas, H. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish muscle. VI. Release determined by both intracellular calcium concentration and depolarization of the nerve terminal. Pflügers Arch. 399, 1-10 (1983).
  43. Fatt, P., Katz, B. Distributed 'endplate potentials' of crustacean muscle fibres. J. exp. Biol. 30, 433-439 (1953).
  44. Florey, E., Cahill, M. A. The innervation pattern of crustacean skeletal muscle. Cell Tissue Res. 224, 527-541 (1982).
  45. Govind, C. K., Pearce, J., Wojtowicz, J. M., Atwood, H. L. Strong and weak synaptic differentiation in the crayfish opener muscle: structural correlates. Synapse. 16, 45-58 (1994).
  46. Günzel, D., Galler, S., Rathamayer, W. Fibre heterogeneity in the closer and opener muscles of the crayfish walking legs. J. Exp. Biol. 175, 267-281 (1993).
  47. He, P., Southard, R. C., Whiteheart, S. W., Cooper, R. L. Role of alpha-SNAP in promoting efficient neurotransmission at the crayfish neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 82, 3406-3416 (1999).
  48. Hochner, B., Parnas, H., Parnas, I. Membrane depolarization evokes neurotransmitter release in the absence of calcium entry. Nature. 342, (6248), 433-435 (1989).
  49. Huxley, T. H. The crayfish an introduction to the study of zoology. Series Landmarks of Science. C. Kegan Paul. London. (1880).
  50. Iravani, J. Membrandepolarisation der Muskelfasern des öffnermuskels des Flusskrebses auf Nervenreiz und Kaliumapplikation. Experientia. 21, 609-610 (1965).
  51. Jahromi, S. S., Atwood, H. L. Three-dimensional ultrastructure of the crayfish neuromuscular apparatus. J Cell Biol. 63, 599-613 (1974).
  52. Katz, B. Neuro-muscular transmission in invertebrates. Biol. Rev. 24, 1-20 (1949).
  53. Katz, B., Kuffler, S. W. Excitation of the nerve-muscle system in crustacea. Proc. R. Soc. Lond. B. 133, 374-389 (1946).
  54. Katz, P. S., Kirk, M. D., Govind, C. K. Facilitation and depression at different branches of the same motor axon: evidence for presynaptic differences in release. J. Neurosci. 13, (7), 3075-3089 (1993).
  55. Kerkut, G. A., Leake, L. D., Shapira, A., Cowan, S., Walker, R. J. The presence of glutamate in nerve-muscle perfusates of Helix. Carcinus and Periplaneta. Comp Biochem Physiol. 15, (4), 485-502 (1965).
  56. Kravitz, E. A. Enzymic formation of gamma-aminobutyric acid in the peripheral and central nervous system of lobsters. J Neurochem. 9, 363-370 (1962).
  57. Kravitz, E. A., Kuffler, S. W., Potter, D. D., Vangelder, N. M. Gamma-aminobutyric acid and other blocking compounds in Crustacea. II. Peripheral nervous system. J. Neurophysiol. 26, 729-738 (1963).
  58. Kravitz, E. A., Kuffler, S. W., Potter, D. D. Gamma-aminobutyric acid and other blocking compounds in Crustacea. III. Their relative concentrations in separated motor and inhibitory axons. J Neurophysiol. 26, 751-75 (1963).
  59. Kravitz, E. A., Molinoff, P. B., Hall, Z. W. A comparison of the enzymes and substrates of gamma-aminobutyric acid metabolism in lobster excitatory and inhibitory axons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 54, 778-782 (1965).
  60. Kravitz, E. A., Potter, D. D. A further study of the distribution of -aminobutyric acid between excitatory and inhibitory axons of the lobster. J. Neurochem. 12, 323-328 (1965).
  61. Lancaster, M., Viele, K., Johnstone, A. F. M., Cooper, R. L. Automated classification of evoked quantal events. J. Neurosci. Meth. 159, 325-336 (2007).
  62. Lnenicka, G. A., Mellon, D. Jr Changes in electrical properties and quantal current during growth of identified muscle fibres in the crayfish. J. Physiol. 345, 261-284 (1983).
  63. Linder, T. M. The accumulative properties of facilitation at crayfish neuromuscular synapses. J. Physiol., Lond. 238, 223-234 (1974).
  64. Ling, G., Gerard, R. W. The normal membrane potential of frog sartorius fibers. J. Cell. Comp. Physiol. 34, 383-396 (1949).
  65. Logsdon, S., Johnstone, A. F. M., Viele, K., Cooper, R. L. The regulation of synaptic vesicles pools within motor nerve terminals during short-term facilitation and neuromodulation. J. Applied Physiol. 100, 662-671 (2005).
  66. Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).
  67. Mallart, A. Calcium dependent modulation of the facilitation of transmitter release at neuromuscular junctions of Drosophila. J. Physiol. (Paris). 87, 83-88 (1993).
  68. Mulkey, R. M., Zucker, R. S. Action potentials must admit calcium to evoke transmitter release. Nature. 350, 152-155 (1991).
  69. Mulkey, R. M., Zucker, R. S. Calcium released by photolysis of DM-nitrophen triggers transmitter release at the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. 462, 243-260 (1993).
  70. Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and lobster. J. Exp. Bio. 205, 513-522 (2002).
  71. Nudell, B. M., Grinnell, A. D. Regulation of synaptic position, size, and strength in anuran skeletal muscle. J Neurosci. 3, (1), 161-176 (1983).
  72. Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release and of entry and removal of calcium. Pflügers Arch. 393, 1-14 (1982).
  73. Parnas, I., Parnas, H., Dudel, J. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish muscle. II. Duration of facilitation and removal processes of calcium from the terminal. Pflügers Arch. 393, 323-326 (1982).
  74. Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. IV. The effect of Mg2+ ions on the duration of facilitation. Pflügers Arch. 395, 1-5 (1982).
  75. Parnas, I., Parnas, H., Dudel, J. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish muscle. V. Basis for synapse differentiation of the fast and slow type in one axon. Pflügers Arch. 395, 261-270 (1982).
  76. Robbins, J. The excitation and inhibition of crustacean muscle by amino acids. J. Physiol. 148, 39-50 (1959).
  77. Richet, C. Contribution a la physiologic des centres nerveux et des muscles de l'ecrevisse. Arch. de Physiol. 6, 263-523 (1879).
  78. Physiologie des muscles et des nerfs. Le ons prof sees la Facult de m decine en 1881, par Charles Richet. Paris, G. Bailli re. (1881).
  79. Ringer, S. Regarding the action of hydrate of soda, hydrate of ammonia, and hydrate of potash on the ventricle of the frog's heart. J. Physiol. 3, 195-202 (1882).
  80. Ringer, S. Concerning the influence exerted by each of the constituents of the blood on the contraction of the ventricle. J. Physiol. 3, 380-393 (1882).
  81. Ruffner, M. E., Cromarty, S. I., Cooper, R. L. Depression of synaptic efficacy in Drosophila neuromuscular junctions by the molting hormone (20-Hydroxyecdysone). J. Neurophysiol. 81, 788-794 (1999).
  82. Sherman, R. G., Atwood, H. L. Synaptic facilitation: Long term neuromuscular facilitation in crustaceans. Science. 171, 1248-1250 (1971).
  83. Sherman, R. G., Atwood, H. L. Correlated electrophysiological and ultrastructural studies of a crustacean motor unit. J. Gen. Physiol. 59, 586-615 (1972).
  84. Sparks, G., Cooper, R. L. 5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation. J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).
  85. Sparks, G. M., Dasari, S., Cooper, R. L. Actions of MDMA at glutamatergic neuromuscular junctions. Neurosci. Res. 48, 431-438 (2004).
  86. Sparks, G. M., Brailoiu, E., Brailoiu, C., Dun, N. J., Tabor, J., Cooper, R. L. Effects of m-CPP in altering neuronal function: Blocking depolarization in invertebrate motor & sensory neurons but exciting rat sensory neurons. Brain Res. 969, 14-26 (2003).
  87. Southard, R. C., Haggard, J., Crider, M. E., Whiteheart, S. W., Cooper, R. L. Influence of serotonin on the kinetics of vesicular release. Brain Res. 871, 16-28 (2000).
  88. Stühmer, W., Roberts, W. S., Almers, W. The loose patch clamp. Single channel recordings. Sakmann, B., Neher, E. Plenum Press. New York. 123-132 (1983).
  89. Tabor, J., Cooper, R. L. Physiologically identified 5-HT2 -like receptors at the crayfish neuromuscular junction. Brain Res. 932, 91-98 (2002).
  90. Van Harreveld, A., Mendelson, M. Glutamate-induced contractions in crustacean muscle. J. Cell Comp. Physiol. 54, 85-94 (1959).
  91. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustaceans. Proc. Soc Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).
  92. Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. The Triple Innervation of the Crayfish Muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, (11), 667 (1936).
  93. Viele, K., Lancaster, M., Cooper, R. L. The self-modeling structure of evoked post-synaptic potentials. Synapse. 60, 32-44 (2006).
  94. Viele, K., Stromberg, A., Cooper, R. L. Determining the number of release sites within the nerve terminal by statistical analysis of synaptic current characteristics. Synapse. 47, 15-25 (2003).
  95. Vyshedskiy, A., Lin, J. -W. Study of the inhibitor of the crayfish neuromuscular junction by presynaptic voltage control. J. Neurophysiol. 77, 103-115 (1997).
  96. Vyshedskiy, A., Lin, J. -W. Activation and detection of facilitation as studied by presynaptic voltage control at the inhibitor of the crayfish opener muscle. J. Neurophysiol. 77, 2300-2315 (1997).
  97. Vyshedskiy, A., Lin, J. -W. Change of transmitter release kinetics during facilitation revealed by prolong test pulses at the inhibitor of the crayfish opener muscle. J. Neurophysiol. 78, 1791-1799 (1997).
  98. Wiersma, C. A. G. Synaptic facilitation in the crayfish. J. Neurophysiol. 12, 267-275 (1949).
  99. Winslow, J. L., Duffy, S. N., Charlton, M. P. Homosynaptic facilitation of transmitter release in crayfish is not affected by mobile calcium chelators: implications for the residual ionized calcium hypothesis from electrophysiological and computational analyses. J. Neurophysiol. 72, 1769-1793 (1994).
  100. Winslow, J. L., Cooper, R. L., Atwood, H. L. Sodium in presynaptic nerve terminals in response to stimulation. J. Neurosci. Meth. 118, 163-175 (2002).
  101. Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. Activity-dependent recruitment of silent synapses. Ann. NY Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).
  102. Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J. Physiol., Lond. 229, 787-810 (1973).
  103. Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J. Physiol. (Lond). 241, 69-89 (1974).
  104. Zucker, R. S. Characteristics of crayfish neuromuscular facilitation and their calcium dependence. J. Physiol., Lond. 241, 91-110 (1974).
  105. Zucker, R. S., Haydon, P. G. Membrane potential has no direct role in evoking neurotransmitter release. Nature. 335, 360-362 (1988).
Historische Ansicht und Physiologie Demonstration am NMJ der Crayfish Opener Muscle
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).More

Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter