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Biology

微量法测定蛋白浓度使用NanoDrop 2000C分光光度计

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

微量样品定量分光光度计系统,采用天然的表面张力,无需使用比色皿或毛细血管保留样本。用这种方法的动态范围,通过它们可以测量蛋白质浓度和速度都大大增加。

Abstract

传统的分光需要样品放入试管或毛细血管。这往往是不切实际的,由于有限的样本通常用于蛋白质分析的卷的。 Thermo Scientific的NanoDrop 2000C分光光度计解决这个问题与创新的样品保留系统,拥有两个使用液体的表面张力特性测量表面的微量样品,使卷在低0.5-2μL的样品定量。消除试管或毛细血管允许在实时路径的长度变化,从而降低了测量时间,同时大大提高了动态范围,可以测量蛋白质浓度。需要稀释,也消除了,并准备样品定量测量表面可以简单的实验室擦拭擦拭相对容易。此视频文章提出修改传统的蛋白浓度测定方法微量蛋白质的金额使用A280吸光度读数或BCA比色法定量。

Protocol

一NanoDrop 2000C分光光度计

NanoDrop技术是基于一个创新的样品保留系统使用的表面张力,保持和测量两个光学基座之间没有使用试管或毛细血管微量样品。 NanoDrop 2000C分光光度计使用这项技术,快速,方便地测量0.5-2μL,液滴的蛋白质,DNA,RNA,和其他生物大分子。这种能力已变得越来越重要的分子生物学技术的不断发展,使用数额较小的材料进行分析。在样本有限的条件下的微量分光光度计的理想选择。然而,易于使用,快速测量周期,和广泛的浓度范围内,也使分光光度计适合当充足的样本量。测量周期也大大降低,帮助科学家提高其整个工作流程的效率。

microsample是直接放置在检测表面的顶部和表面张力的光纤的两端之间创建一个液柱。这液柱形成了一个垂直的光路。一个氙闪光灯提供光源和光谱仪采用线性CCD阵列是用来分析光通过样品传递。

从系统中删除传统的遏制设备,如试管,有以下几个优点:测量所需要的极少量的样品,清理只需要实验室擦拭抹光表面,可以实时改变路径的长度测量过程中。

NanoDrop 2000C自动确定最优路径长度(1毫米至0.05毫米),未经稀释提供最广泛的可能的蛋白浓度测量。通过缩短路径长度,较高浓度的蛋白质可以衡量的。这有效地消除了需要执行的大多数蛋白质样品稀释。例如,NanoDrop 2000C可以测量BSA的浓度高达400毫克/毫升。

NanoDrop 2000C分光光度计是一种全方位的DNA,RNA,蛋白质和其他生物大分子的吸光度测量分光光度计。这个视频协议,将侧重于测量的蛋白质。

二。微量法测定蛋白浓度使用A280吸光度测量

A. A280测量原理

蛋白质A280方法是适用于纯化的蛋白质含有色氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸残基或半胱氨酸半胱氨酸二硫键和展览在280 nm处的吸光度。这种方法使用的质量消光系数,摩尔消光系数A280吸光度值,计算纯化的蛋白浓度组合。直接A280测量的优点是不需要标准曲线的生成,以确定蛋白质浓度。如果样品是一个未知的蛋白质溶液,细胞裂解液,或粗蛋白提取物,然后使用预先配置的比色方法,如NanoDrop 2000/2000c BCA,皮尔斯660纳米,布拉德福德和洛瑞检测之一,是建议。

B.微量蛋白质A280测量 - 启动

  1. 选择从主菜单中的蛋白质A280应用程序。
  2. 选择从下拉列表中测量样品类型。默认设置为推荐未知蛋白质的混合​​物,其中1 ABS = 1毫克/毫升。如果测量先前特点的纯化蛋白质,然后大规模灭绝系数或摩尔消光系数和分子量可进入更精确地确定蛋白浓度。
  3. 从下拉列表中选择浓度单位。

C.微量蛋白质A280测量 - 消隐

  1. 使用适当的缓冲区,建立一个空白。重要的是要使用其中的蛋白质暂停缓冲。使用缓冲区应该是相同的的pH值和一个类似的样品溶液的离子强度。注:RIPA缓冲区贡献太多吸光度在280 nm,因此不符合直接A280蛋白质测量。悬浮在RIPA缓冲液的蛋白质,它是建议使用一个兼容RIPA缓冲液比色法测定蛋白浓度。
  2. 加入2μL的底部基座上,适当的消隐的解决方案,降低了手臂,然后单击空白。
  3. 擦拭从空白的最低和最高使用干燥的实验室擦拭基座解决方案。

D.微量蛋白质A280三围尺寸

重要注意事项:同质化的样本是极其因为这种体积小,重要的是被测量。为了确保样品均匀,轻轻地,彻底混合样品前测量等分。混合和移液时,避免引入气泡。

由于在不同的蛋白质之间的表面张力变异,我们建议加载2μL的样品,以确保形成正确的列。始终使用低保留枪头。要加载一个样本,同时驱逐的解决方案,以防止从坚持枪头外解决方案,触摸枪头,以较低的光学基座表面。比样品量,样品中的气泡,防止井喷和引进排出少。

  1. 在相应字段中输入一个样品编号,负载2μL为空白,然后单击措施的第一个样本。一个新鲜的样品2μL等分应当用于每次测量。
  2. 取出的最低和最高使用干燥的实验室擦拭基座样品。

E.微量蛋白质A280测量清洁

一个普通的,不掉毛,实验室擦拭往往是足够的清洁光学测量之间的底座。

F.使蛋白质A280测量翻新

含有表面活性剂的解决方案和试剂,可能会uncondition随着时间的推移测量底座的表面,防止样品液柱形成。扁平化是一个较低的底座上的液滴成为无条件的光学表面的指标。如果表面性质已被泄露,翻新基座重要的是要确保样品列形成。如果发生这种情况,BUFF的大力使用实验室擦拭或使用NanoDrop立柱检修复合(PR - 1)的指示的光学表面。

三。微量法测定蛋白浓度使用比色法

A.比色法检测原理

NanoDrop 2000C分光光度计也可以用来测量未知的蛋白质溶液,细胞裂解液,粗蛋白提取物,采用比色法。

色度的方法是间接的方法,包括与样品的蛋白质成分的染料能吸收光线在可见光波长范围内产生一个新的复杂的相互作用。

NanoDrop 2000C分光光度计有几个预配置,包括基本能力评估,,布拉德福德,皮尔斯660和Lowry方法比色法。 BCA法测定将展示使用微量分光光度计比色法检测作为一个例子。 (截图)

BCA(Bicinchoninic酸)法是一种常见的比色法通常用于稀的蛋白质溶液和蛋白质中存在的组件,具有显着的紫外线(280纳米)的吸光度。不同于蛋白质的A280方法,蛋白质的基本能力评估方法的要求,之前生成,可以测量样品中蛋白质浓度的标准曲线。

该方法采用的检测试剂bicinchoninic酸(BCA)。测量562纳米铜BCA螯合形成的蛋白质的存在,并在750 nm的正常化。

B.微量BCA法测定测量BCA含量的制备

  1. 所需的试剂都包含在还原剂兼容工具包(Thermo Scientific的皮尔斯猫没有23250。):BCA试剂,BCA试剂B,兼容性试剂,重组缓冲区,和白蛋白(BSA)标准。
  2. 所有未知的蛋白质和蛋白质的标准平衡至室温,调匀。
  3. 准备足够的标准和要测量的样品使用的试剂50:1的比例一个新的工作试剂:乙
  4. 对于微检测,使用工作试剂按1:1的比例进行采样。加入10μL的工作有足够的管试剂每管以涵盖所有样品和标准。对于高音域的检测,工作试剂的使用20:1的比例进行采样。加入190μL的工作有足够的管试剂每管以涵盖所有样品和标准。皮尔斯BCA试剂盒文学,以确定其中的比例是适合您的样品。
  5. 含试剂每管加入10μL标准品或样品。充分混匀,轻轻振荡。
  6. 管在37 ° C下30分钟。
  7. 允许的反应,以平衡至室温(约10分钟)。

C.微量BCA法测定测量生成标准曲线

  1. 选择从主菜单中的蛋白质的基本能力评估方法。如果波长出现验证窗口,确保手臂下来。
  2. 在右窗格中的表的标准浓度为每输入值。该软件允许参考和高达7 additional标准。应在重复测量基准和/或标准。
    注:标准曲线生成的最低要求是两个标准的测量或零的参考,并至少有一个标准的测量。这是建议,包括必要的覆盖预期的实验浓度范围内的其他标准。
  3. 建立一个空白。比色法空白一般用去离子H 2 O。
  4. 加入2μL生署2,将底部基座,较低的手臂,然后单击空白。只有一个空白是必要的职权范围和标准的所有后续测量。
  5. 建立吸取2微升等份,含蛋白质没有到较低的底座只工作试剂和缓冲的参考。下手臂,然后单击测量。
  6. 规定的标准“选项卡上,突出显示所需的标准所需的较低的底座上的标准,并加入2微升。下手臂,然后单击测量。重复所有的标准的过程中。请务必来衡量一切的标准测量样品之前。要查看标准曲线,单击“查看标准曲线。

D.微量BCA法测定测量2μL,蛋白质测量

  1. 已测的所有标准后,点击“样本”按钮。输入样品编号。加载到较低的底座2μL的样品,并单击“测量”。一个新鲜的2μL的样品分装,应使用每个测量。
  2. 用的最低和最高使用干燥的实验室擦拭基座样品。

E.微量BCA法测定测量清洗和翻新

进行清洗和翻新直接A280吸光度测量。

代表性的成果:

微量法测定蛋白浓度是由一个直接的A280测量或间接比色法。 A280测量例如决定对感兴趣的蛋白质的消光系数为基础的蛋白浓度。 BCA比色法示例确定一个已知的蛋白质浓度的标准曲线为基础的蛋白浓度。

Discussion

微量定量使用一个样品的内在的表面张力特性,形成了两种测量表面之间的液柱。遏制设备的情况下,允许实时路径的长度来改变,根本上消除了需要进行稀释。这种能力显着提高蛋白浓度的动态范围以及测量速度。通过使用极少量的样品,大量的样品,可以快速,准确地分析,使科学家能够采取更多的测量,并实现更好的质量控制。此外,如果必要的话,宝贵的样品可以测量后收回。这样的小卷正在测量时,样品的均匀性是极为重要的的,以避免抽样误差。低保留枪头应始终被用于装载样本之间的样品复制,提示应改为。基座表面必须正确清洁和空调,以确保最准确的结果。最后,微量分光光度计是理想然而,当样品是有限的,易于使用,速度,和广泛的光谱仪的动态范围,使其适合时,样品是丰富的。

Disclosures

作者是赛默飞世尔科技产生本文中使用的试剂和工具的员工。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

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References

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Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

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