Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Microvolume Eiwitconcentratie Bepaling met behulp van de NanoDrop 2000C Spectrophotometer

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

Microvolume monsters worden gekwantificeerd door een spectrofotometer systeem dat natuurlijke oppervlaktespanning gebruikt om monsters te behouden zonder het gebruik van cuvetten of haarvaten. Het dynamisch bereik van eiwitconcentraties en de snelheid waarmee ze kunnen worden gemeten zijn sterk verhoogd met deze methode.

Abstract

Traditionele spectrofotometrie vereist het plaatsen van monsters in cuvetten of haarvaten. Dit is vaak niet praktisch vanwege de beperkte steekproef volumes vaak gebruikt voor eiwit analyse. De Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer lost dit probleem op met een innovatief voorbeeld retentie systeem dat microvolume monsters houdt tussen de twee metingen oppervlakken met behulp van de oppervlaktespanning eigenschappen van vloeistoffen, waardoor de kwantificering van de monsters van het volume zo laag als 0.5-2 pi. De eliminatie van cuvetten of haarvaten geeft real-time veranderingen in de weglengte, die de meettijd vermindert en tegelijkertijd aanzienlijke verhoging van de dynamische bereik van eiwit concentraties die gemeten kan worden. De behoefte aan verdunningen is eveneens geëlimineerd, en de voorbereidingen voor sample kwantificering zijn relatief makkelijk als het meten oppervlak kan eenvoudig worden afgeveegd met laboratorium te vegen. Deze video artikel geeft aanpassingen aan de traditionele eiwitconcentratie bepalingsmethoden voor de kwantificering van microvolume hoeveelheden eiwit met behulp van A280 absorptie metingen of de BCA colorimetrische test.

Protocol

I. De NanoDrop 2000c Spectrophotometer

NanoDrop technologie is gebaseerd op een innovatief steekproef retentie systeem dat de oppervlaktespanning aan te houden en microvolume monsters te meten tussen twee optische voetstukken zonder het gebruik van cuvetten of haarvaten gebruikt. De NanoDrop 2000C spectrofotometer gebruikt deze technologie om snel en eenvoudig te meten 0,5-2 pi druppels van eiwitten, DNA, RNA, en andere biomoleculen. Deze mogelijkheid is steeds belangrijker geworden als moleculaire technieken voortdurend evolueren naar kleinere hoeveelheden van het materiaal te gebruiken voor analyse. De microvolume spectrofotometer ideaal voor omstandigheden waarin monster is beperkt. Echter, het gemak-of-gebruik, snelle meting fiets-en, en een uitgebreide concentratiebereik ook de spectrofotometer geschikt wanneer een ruime hoeveelheid van het monster beschikbaar. De meetcyclus is ook sterk verminderd, wetenschappers te helpen efficiëntie te verhogen gedurende hun workflows.

De microproefcel wordt direct geplaatst op de top van de detectie oppervlak en een vloeistofkolom wordt gecreëerd tussen de uiteinden van de optische vezels door oppervlaktespanning. Deze vloeistof kolom vormt een verticale optische pad. Een xenon flash lamp zorgt voor de lichtbron en een spectrometer met behulp van een lineaire CCD-array wordt gebruikt om het licht dat door het monster te analyseren.

Het verwijderen van traditional containment-apparaten zoals cuvetten uit het systeem heeft verschillende voordelen: zeer kleine hoeveelheden van het monster nodig zijn voor het meten, opruimen gewoon nodig af te vegen van de optische vlakken met een laboratorium af te vegen, en het pad lengte kan veranderen in real time worden tijdens de meting.

De NanoDrop 2000C bepaalt de optimale weglengte automatisch (1 mm tot 0,05 mm), het verstrekken van de meest uitgebreide scala aan mogelijke eiwitconcentratie metingen zonder verdunningen. Door verkorting van de weglengte, kunnen hogere concentraties van eiwitten worden gemeten. Dit verwijdert effectief de noodzaak om de verdunningen uit te voeren voor de meeste eiwit monsters. Bijvoorbeeld, kan de NanoDrop 2000C maat BSA concentraties zo hoog als 400 mg / ml.

De NanoDrop 2000C Spectrofotometer is een volledig spectrum spectrofotometer voor het meten van de absorptie van DNA, RNA, eiwitten en andere biomoleculen. Deze video protocol zal zich richten op het meten van eiwitten.

II. Microvolume Eiwitconcentratie Bepaling Met behulp van A280 extinctiemetingen

a. Principe van de A280 Afmetingen

De Protein A280 methode is van toepassing op gezuiverde eiwitten die tryptofaan, tyrosine, fenylalanine residuen of Cysteine-Cysteine ​​disulfide obligaties en exposeren absorptie bij 280 nm bevatten. Deze methode maakt gebruik van de A280 absorptie waarde in combinatie met de massa-extinctie coëfficiënt of de molaire extinctiecoëfficiënt de berekening van de concentratie van het gezuiverde eiwit. Het voordeel van directe A280 metingen is dat de generatie van een standaard curve niet hoeft te eiwitconcentratie te bepalen. Indien het monster is een gekarakteriseerde eiwitten oplossing, cellysaat of ruw eiwit extract, dan met een van de pre-geconfigureerde colorimetrische methoden beschikbaar zijn op de NanoDrop 2000/2000c, zoals BCA, Pierce 660 nm, Bradford, en Lowry assays, is aanbevolen.

b. Microvolume Protein A280 metingen - Startup

  1. Selecteer de Protein A280 toepassing in het hoofdmenu.
  2. Selecteer het type van het monster te meten van de drop-down lijst. De standaard instelling is aanbevolen voor de meeste onbekend eiwit mengsels waarin een Abs = 1 mg / ml. Als het meten van een eerder gekenmerkt wordt gezuiverd eiwit, dan is ofwel de massa-extinctie coëfficiënt of molaire extinctiecoëfficiënt en moleculair gewicht kan worden ingevoerd om de eiwitconcentratie nader bepalen.
  3. Kies de concentratie-eenheden van de drop-down lijst.

c. Microvolume Protein A280 metingen - Blanking

  1. Stel een blanco behulp van een geschikte buffer. Het is belangrijk dat het gebruik van de buffer, waarin het eiwit is opgeschort. De gebruikte buffer moet dezelfde pH-waarde en van een soortgelijke ionische sterkte als de monsteroplossing worden. Let op: RIPA buffers bijdragen te veel absorptie bij 280 nm en zijn derhalve onverenigbaar met directe A280 eiwit metingen. Voor eiwitten gesuspendeerd in een RIPA buffer, is het aanbevolen eiwit concentratie worden bepaald met behulp van een RIPA-buffer compatibel colorimetrische test.
  2. Pipetteer 2 pi van de juiste blanking oplossing op de bodem voetstuk, hoe lager de arm en klik op Blank.
  3. Veeg de blanco-oplossing uit de onderste en bovenste sokkels met een droge laboratorium af te vegen.

d. Microvolume Protein A280 Afmetingen meten

Belangrijke overwegingen: De homogeniteit van het monster is uiterstbelangrijk, aangezien zo'n klein volume wordt gemeten. Om ervoor te zorgen dat de monsters homogeen zijn, grondig, maar voorzichtig meteen meng de monsters voorafgaande aan het nemen van een aliquot voor de meting. Voorkomen dat er luchtbellen bij het mengen en pipetteren.

Door de variatie in oppervlaktespanning tussen de verschillende eiwitten, raden wij aan het laden 2 il van de monsters om een ​​goede column vorming te verzekeren. Gebruik altijd een lage retentie pipetpunten. Voor het laden van een sample, raakt u de pipet tip om het onderste optische voetstuk oppervlak, terwijl het verdrijven van de oplossing om de oplossing te verhinderen zich te houden aan de buitenkant van de pipet tip. Verdrijf minder dan het volledige bedrag van het monster tot uitbarsting en de invoering van bubbels in het monster te voorkomen.

  1. Voer een monster ID in het daarvoor bestemde veld, belasting 2 pi van het eerste monster, zoals beschreven voor de blanco en klik op Meting. Een frisse 2μL hoeveelheid van het monster moet worden gebruikt voor elke meting.
  2. Neem het monster uit de onderste en bovenste sokkels met een droge laboratorium af te vegen.

e. Microvolume Protein A280 Afmetingen Cleaning

Een gewone, niet-pluizende, veeg laboratorium is vaak voldoende voor het reinigen van de optische voetstukken tussen de metingen.

f. Het maken van Protein A280 Afmetingen Reconditionering

Oplossingen en reagentia bevatten oppervlakteactieve stoffen kunnen deconditioneren de meting sokkel oppervlakken loop van de tijd, het voorkomen van het monster vloeistofkolom te vormen. Een afvlakking van de druppel op de lagere sokkel is een indicatie van de optische oppervlak worden ongeconditioneerd. Als de oppervlakte-eigenschappen zijn gecompromitteerd, opnieuw conditioneren van de zuilen is van belang om ervoor te zorgen monster kolom formatie. Als dit gebeurt, buff de optische oppervlakken krachtig met behulp van laboratorium vegen of gebruik NanoDrop Pedestal Reconditionering Compound (PR-1) zoals aangegeven.

III. Microvolume Eiwitconcentratie bepaling met behulp van Colorimetrische Assays

a. Principe van de colorimetrische detectie

De NanoDrop 2000C spectrofotometer kan ook worden gebruikt om gekarakteriseerde eiwitoplossingen, cellysaten, en ruw eiwit extracten met behulp van colorimetrische testen te meten.

Colorimetrische methoden zijn indirecte methoden die interactie van een kleurstof met het eiwit component van het monster aan een nieuw complex dat het licht absorbeert in het zichtbare golflengtegebied, te produceren.

De NanoDrop 2000C spectrofotometer heeft een aantal vooraf geconfigureerde colorimetrische proeven, waaronder BCA, Pierce 660, Bradford, en Lowry methoden. De BCA assay zullen worden gedemonstreerd als een voorbeeld colorimetrische test met behulp van een microvolume spectrofotometer. (Screenshot)

De BCA (Bicinchoninic Acid) test is een veel voorkomende colorimetrische methode vaak gebruikt voor het verdunnen eiwitoplossingen en eiwitten in de aanwezigheid van componenten die significante UV (280 nm) absorptie hebben. In tegenstelling tot de Protein A280 methode, de Protein BCA methode vereist dat er een standaard curve worden gegenereerd voor de sample eiwit concentraties kunnen worden gemeten.

De methode maakt gebruik van bicinchoninic zuur (BCA) als de detectie reagens. De Cu-BCA chelaat gevormd in de aanwezigheid van eiwit is gemeten bij 562 nm en genormaliseerd bij 750 nm.

b. Microvolume BCA Assay Afmetingen BCA Assay Voorbereiding

  1. De vereiste reagentia zijn opgenomen in het reductiemiddel compatibele kit (Thermo Scientific Pierce kat geen 23.250..): BCA reagens A, BCA reagens B, compatibiliteit reagens, Reconstitutie buffer, en albumine (BSA) normen.
  2. Equilibreren alle onbekende eiwitten en eiwitten normen op kamertemperatuur en meng.
  3. Bereid voldoende verse werken reagens voor de normen en monsters te meten met behulp van een 50:1 verhouding van reagens A: B
  4. Voor de micro-test, gebruik dan een 1:1 verhouding van werken reagens om te proeven. Voeg 10 pi van het werken reagens aan elke buis met voldoende buizen om alle monsters en standaarden te dekken. Voor de high-range-test, gebruik maken van een 20:1-ratio van het werken reagens om te proeven. Voeg 190 ul van werken reagens aan elke buis met voldoende buizen om alle monsters en standaarden te dekken. Raadpleeg de Pierce BCA kit literatuur om te bepalen welke verhouding geschikt is voor uw monsters.
  5. Voeg 10 ul van standaard of monster aan elke buis met reagens. Meng goed door voorzichtig vortexen.
  6. Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  7. Laat de reacties op op kamertemperatuur (~ 10 minuten).

c. Microvolume BCA Assay Afmetingen genereren Standard Curve

  1. Selecteer de Protein BCA methode van het hoofdmenu. Als de golflengte verificatie venster verschijnt, moet de arm naar beneden.
  2. Voer de waarden voor elke standaard concentratie in het rechterdeelvenster tafel. De software zorgt voor de verwijzing en tot 7 Additional normen. De Referentie-en / of de normen moeten worden gemeten in repliceert.
    Opmerking: De minimale eis voor standaardcurve generatie is het meten van de twee normen of het meten van de nul-referentie-en ten minste een standaard. Het wordt aanbevolen dat er aanvullende normen opgenomen als nodig is om het verwachte test concentratiebereik te dekken.
  3. Stel een blanco. De lege voor de colorimetrische testen is over het algemeen gedemineraliseerd H 2 O.
  4. Pipetteer 2 pi van DH 2 O op de bodem voetstuk, hoe lager de arm en klik op Blank. Slechts een blanco is noodzakelijk om alle latere metingen van de referentie-en normen te dekken.
  5. Bepaal de verwijzing door pipetteren een 2 pi aliquot met alleen werken reagens en buffer met geen eiwit op de onderste voetstuk. Laat de arm en klik op Meting.
  6. Onder het tabblad Normen, markeert u de gewenste standaard en pipet 2 pi van de gewenste standaard op de onderste voetstuk. Laat de arm en klik op Meting. Herhaal dit proces voor alle normen. Zorg ervoor dat u vooraf te meten alle normen voor het meten van monsters. Om standaard curve klikt u op Standard Curve.

d. Microvolume BCA Assay Afmetingen 2 pl Protein Afmetingen

  1. Nadat alle van de normen zijn gemeten, klikt u op de knop Samples. Voer de sample-ID. Laad 2 pl van het monster op de lagere voetstuk en klik op Meting. Een frisse 2 pi aliquot van het monster moet worden gebruikt voor elke meting.
  2. Veeg het monster uit de onderste en bovenste sokkels met een droge laboratorium af te vegen.

e. Microvolume BCA Assay Afmetingen Reiniging en Revisie

Voer reiniging en revisie, zoals beschreven in de directe A280 absorptie metingen.

Representatieve resultaten:

Microvolume eiwitconcentratie bepaling wordt verricht door ofwel een direct A280 meting of een indirecte colorimetrische test. De A280 meting bijvoorbeeld bepaalt eiwitconcentratie op basis van de extinctiecoëfficiënt van het eiwit van belang. De BCA colorimetrische assay bijvoorbeeld bepaalt eiwitconcentratie op basis van een standaard curve van bekende eiwit concentraties.

Discussion

Microvolume kwantificatie maakt gebruik van de intrinsieke oppervlaktespanning eigenschappen van een monster te vormen een vloeistofkolom tussen de twee metingen oppervlakken. Het ontbreken van een containment-apparaat, kan de padlengte te veranderen in real-time, in wezen waardoor de noodzaak om verdunningen uit te voeren. Deze mogelijkheid verhoogt dramatisch de dynamische bereik van eiwit concentraties alsmede de snelheid van de meting. Door het gebruik van minimale hoeveelheden van het monster, kan een groot aantal monsters snel en nauwkeurig worden geanalyseerd, waardoor wetenschappers meer metingen te doen en een betere kwaliteitscontrole te bereiken. Daarnaast, en indien nodig, kan kostbare monsters worden hersteld na het nemen van een meting. Wanneer dergelijke kleine volumes worden gemeten, monster homogeniteit is zeer belangrijk om te voorkomen dat steekproeffouten. Lage retentie pipetpunten dient altijd te worden gebruikt voor het laden monsters en de tips moeten worden aangepast tussen de sample repliceert. De sokkel oppervlakken moeten goed worden gereinigd en geconditioneerd om de meest accurate resultaten te waarborgen. Ten slotte is de microvolume spectrofotometer ideaal is als monster wordt echter beperkt, het gemak-of-gebruik, snelheid, en uitgebreide dynamische bereik van de spectrometer maakt het geschikt als monster overvloedig is.

Disclosures

De auteurs zijn werknemers van Thermo Fisher Scientific, dat reagentia en instrumenten die in dit artikel oplevert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. (1996).
  2. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  5. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. (2006).
  6. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  7. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).
Microvolume Eiwitconcentratie Bepaling met behulp van de NanoDrop 2000C Spectrophotometer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter