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Biology

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

Mikrovolumen Proben werden mit einem Spektrophotometer, das natürliche Oberflächenspannung verwendet, um Proben ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren behalten quantifiziert. Der dynamische Bereich des Protein-Konzentrationen und die Geschwindigkeit, mit denen sie gemessen werden können, sind stark mit dieser Methode erhöht.

Abstract

Traditionelle Spektrophotometrie erfordert Platzierung Proben in Küvetten oder Kapillaren. Dies ist oft unpraktisch aufgrund der begrenzten Probenmengen oft für Protein-Analyse verwendet. Die Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spektrophotometer löst dieses Problem mit einer innovativen Probenretention System, das Mikrovolumens Proben hält zwischen zwei Messflächen mit der Oberflächenspannung von Flüssigkeiten, wodurch die Quantifizierung von Proben in Mengen so gering wie 0,5-2 ul. Die Beseitigung von Küvetten oder Kapillaren ermöglicht Echtzeit Veränderungen in Weglänge, die die Messung der Zeit verringert, während eine starke Erhöhung der Dynamik von Protein-Konzentrationen, die gemessen werden kann. Die Notwendigkeit für Verdünnungen ist ebenfalls eliminiert, und die Vorbereitungen für die Probe quantifiziert sind relativ einfach, da die Messung Oberflächen können einfach mit Labor wischen abgewischt werden. Dieses Video Artikel stellt Änderungen an traditionellen Proteinkonzentration Bestimmungsmethoden für die Quantifizierung der Mikrovolumens Mengen an Protein mit A280 Absorptionswerte oder der BCA Farbtestverfahren.

Protocol

I. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer

NanoDrop Technologie basiert auf einem innovativen Probenretention System, das die Oberflächenspannung zu halten und zu messen Mikrovolumens Proben zwischen zwei optischen Sockel ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren nutzt. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer verwendet diese Technologie, um schnell und einfach messen 0,5-2 ul Tröpfchen von Proteinen, DNA, RNA und andere Biomoleküle. Diese Fähigkeit ist immer wichtiger geworden als molekulare Techniken ständig weiterentwickeln, um kleinere Mengen an Material für die Analyse verwenden. Die Mikrovolumens Spektrophotometer ideal für Bedingungen, unter denen Probe ist begrenzt. Doch die Einfachheit der Benutzung, schnelle Messzyklus und, und umfangreiche Konzentrationsbereich auch das Spektralphotometer geeignet, wenn ausreichende Mengen der Probe vorhanden sind. Der Messzyklus ist auch stark reduziert, dass den Wissenschaftlern geholfen Steigerung der Effizienz in ihrem Workflows.

Die Mikroprobe wird direkt auf der Detektion Oberfläche platziert und eine Flüssigkeitssäule zwischen den Enden der optischen Fasern durch die Oberflächenspannung erzeugt. Diese Flüssigkeitssäule bildet eine vertikale Strahlengang. Ein Xenon-Blitz-Lampe bietet der Lichtquelle und einem Spektrometer unter Verwendung eines linearen CCD-Array verwendet wird, um das Licht, das durch die Probe geht zu analysieren.

Entfernen traditionellen Containment-Geräte wie Küvetten aus dem System hat mehrere Vorteile: sehr geringe Mengen von Probe für die Messung benötigt, Reinigung erfordert einfach Abwischen der optischen Oberflächen mit einem Labor zu wischen, und die Weglänge in Echtzeit während der Messung verändert werden.

Die NanoDrop 2000c bestimmt die optimale Weglänge automatisch (1 mm bis 0,05 mm) und bietet die umfangreichste Palette von möglichen Proteinkonzentration Messungen ohne Verdünnungen. Durch die Verkürzung der Weglänge, können höhere Konzentrationen an Protein gemessen werden. Hierdurch werden die Notwendigkeit, Verdünnungen für die meisten Protein-Proben durchzuführen. Zum Beispiel kann die NanoDrop 2000c messen BSA-Konzentrationen so hoch wie 400 mg / mL.

Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer ist ein volles Spektrum Spektralphotometer für die Messung der Absorption von DNA, RNA, Proteine ​​und andere Biomoleküle. Dieses Video-Protokoll wird auf der Messung von Proteinen zu konzentrieren.

II. Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung Mit A280 Absorptionsmessung

a. Das Prinzip der A280-Messungen

Das Protein A280 Verfahren ist anwendbar auf gereinigte Proteine, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin Rückstände oder Cystein-Cystein Disulfidbrücken und zeigen Absorption bei 280 nm enthalten. Diese Methode verwendet die A280 Extinktionswert in Kombination mit entweder der Masse Extinktionskoeffizienten oder die molare Extinktionskoeffizient, um die Konzentration des gereinigten Proteins zu berechnen. Der Vorteil der direkten A280 Messungen ist, dass die Erzeugung einer Standardkurve nicht erforderlich ist, um Protein-Konzentration bestimmen. Wenn die Probe ein charakterisierten Protein-Lösung, Zelllysat oder Proteinrohextrakt, dann mit einem der vorkonfigurierten kolorimetrische Methoden finden Sie auf der NanoDrop 2000/2000c, wie BCA, Pierce 660 nm, Bradford und Lowry-Assays wird empfohlen.

b. Mikrovolumen Protein A280 Messungen - Startup

  1. Wählen Sie das Protein A280 Anwendung aus dem Hauptmenü.
  2. Wählen Sie die Art der Probe aus der Dropdown-Liste gemessen werden. Die Standardeinstellung ist für die meisten unbekanntes Protein Mischungen, in denen 1 Abs = 1 mg / mL. Empfohlen Wenn die Messung einer zuvor geprägt gereinigtes Protein, dann ist entweder die Masse Extinktionskoeffizienten oder molaren Extinktionskoeffizienten und Molekulargewicht kann eingegeben werden, um die Protein-Konzentration genauer zu bestimmen.
  3. Wählen Sie die Konzentration Einheiten aus der Dropdown-Liste.

c. Mikrovolumen Protein A280 Messungen - Blanking

  1. Stellen Sie eine leere mit einem geeigneten Puffer. Es ist wichtig, um den Puffer, in dem das Protein suspendiert verwenden. Der Puffer verwendet werden, sollten den gleichen pH-Wert und einer ähnlichen Ionenstärke als die Probelösung werden. Hinweis: RIPA Puffer beitragen zu viel Absorption bei 280 nm und sind daher nicht mit direkten A280 Protein-Messungen. Für Proteine ​​in einer RIPA-Puffer suspendiert, ist es empfehlenswert Proteinkonzentration bestimmt mit einem RIPA Puffer kompatibel Farbtestverfahren werden.
  2. Pipette 2 ul der entsprechenden Blenden-Lösung auf den Boden Sockel, senken Sie den Arm aus und klicken Sie Blank.
  3. Wischen Sie die leere Lösung aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen.

d. Mikrovolumen Protein A280 Messungen Messen

Wichtige Überlegungen: Die Homogenität der Probe ist extremwichtig, da so ein kleines Volumen gemessen wird. Um sicherzustellen, dass die Proben homogen sind, sanft, aber gründlich mischen die Proben unmittelbar vor der Entnahme eines Aliquots für die Messung. Vermeiden Sie die Einführung Blasen beim Mischen und Pipettieren.

Aufgrund der Variabilität der Oberflächenspannung zwischen verschiedenen Proteinen, empfehlen wir loading 2 ul der Proben, um die ordnungsgemäße Spalte Bildung zu gewährleisten. Verwenden Sie immer geringer Retention Pipettenspitzen. So laden Sie eine Probe, berühren Sie die Pipettenspitze auf die geringere optische Sockel Oberfläche, während der Vertreibung der Lösung für die Lösung von der Einhaltung der Außenseite der Pipettenspitze zu verhindern. Expel weniger als den vollen Betrag der Probe Blowout und Einführung von Blasen in der Probe zu verhindern.

  1. Geben Sie einen Proben-ID in das entsprechende Feld, Last 2 ul der ersten Probe für die leer und klicken Sie messen beschrieben. Ein frischer 2μL Aliquot der Probe sollte für jede Messung verwendet werden.
  2. Entfernen Sie die Probe aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen.

e. Mikrovolumen Protein A280 Messungen Reinigung

Ein gewöhnlicher, fusselfreien, Labor wischen reicht oft für die Reinigung der optischen Podesten zwischen den Messungen.

f. Erstellen Protein A280 Messungen Überholung

Lösungen und Reagenzien Tenside kann die Messung Sockel Oberflächen im Laufe der Zeit bedingungslos und verhindert die Probenflüssigkeit Spalte zu bilden. Eine Abflachung des Tropfens auf dem unteren Sockel ist bezeichnend für die optische Oberfläche immer unbedingt. Wenn die Oberflächeneigenschaften beeinträchtigt worden, die Instandsetzung der Sockel ist wichtig, Probe Spalte Bildung zu gewährleisten. Wenn dies geschieht, buff, die optischen Flächen kräftig mit Labor wischen oder NanoDrop Pedestal Überholung Compound (PR-1), wie verwiesen.

III. Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit kolorimetrischen Assays

a. Das Prinzip der kolorimetrischen Nachweis

Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer kann auch verwendet werden, um nicht charakterisierten Protein-Lösungen, Zelllysate, und Rohprotein Extrakten mittels kolorimetrischen Assays zu messen.

Kolorimetrischen Methoden sind indirekte Methoden, die Interaktion eines Farbstoffs mit dem Protein-Komponente der Probe zu einem neuen Komplex, der Licht absorbiert im sichtbaren Wellenlängenbereich produzieren zu beteiligen.

Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer hat mehrere vorkonfigurierte kolorimetrischen Assays einschließlich BCA, Pierce 660, Bradford und Lowry-Methoden. Der BCA-Assay wird als ein Beispiel Farbtestverfahren mit einem Spektralphotometer Mikrovolumens nachgewiesen werden. (Screenshot)

Die BCA (Bicinchoninsäure)-Assay ist ein gemeinsames kolorimetrischen Methode oft für verdünnte Proteinlösungen und Proteine ​​in Gegenwart von Komponenten, die signifikante UV (280 nm) Absorption benutzt haben. Im Gegensatz zu den Protein A280-Methode erfordert die Protein BCA-Methode, die eine Standardkurve generiert, bevor Probe Proteinkonzentrationen gemessen werden kann.

Das Verfahren nutzt Bicinchoninsäure (BCA) als Nachweisreagenz. Die Cu-BCA-Chelat in Gegenwart von Protein gebildet wird bei 562 nm gemessen und normalisiert bei 750 nm.

b. Mikrovolumen BCA Assay Messungen BCA Assay Vorbereitung

  1. BCA-Reagenz A, BCA-Reagenz B, Kompatibilität Reagenz Rekonstitution Puffer und Albumin (BSA)-Standards: Die benötigten Reagenzien sind in das Reduktionsmittel kompatibel Kit (.. Thermo Scientific Pierce Kat.-Nr. 23250) enthalten.
  2. Äquilibrieren alle unbekannten Proteinen und Protein-Standards auf Raumtemperatur und gründlich mischen.
  3. Bereiten Sie genügend frisches arbeiten Reagenz für die Standards und Proben zu messen mit einem 50:1-Verhältnis von Reagenz A: B
  4. Für die Mikro-Assay, mit einem Verhältnis von 1:1 arbeiten Reagenz zur Probe. Fügen Sie 10 ul der Arbeit Reagenz in jedes Röhrchen mit genügend Rohre für alle Proben und Standards abdecken. Für den High-Bereich Assay verwenden ein 20:1-Verhältnis von Arbeit Reagenz zur Probe. Add 190 &mgr; l der Arbeit Reagenz in jedes Röhrchen mit genügend Rohre für alle Proben und Standards abdecken. Lesen Sie die Pierce BCA-Kit Literatur, um festzustellen, welches Verhältnis eignet sich für Ihre Proben.
  5. Fügen Sie 10 ul Standard bzw. Probe in jedes Röhrchen Reagenz. Gut mischen durch vorsichtiges Vortexen.
  6. Die Röhrchen bei 37 ° C für 30 Minuten.
  7. Lassen Sie die Reaktionen auf Raumtemperatur (~ 10 Minuten) ausgleichen.

c. Mikrovolumen BCA Assay Messungen Generierung Standardkurve

  1. Wählen Sie das Protein BCA-Methode aus dem Hauptmenü. Wenn die Wellenlänge Überprüfung angezeigt wird, sicherzustellen, wird der Arm nach unten.
  2. Geben Sie die Werte für jedes Standard-Konzentration im rechten Fensterbereich Tisch. Die Software ermöglicht die Referenz-und bis zu 7 additional Standards. Die Bezugs-und / oder Standards sollten in Wiederholungen gemessen werden.
    Hinweis: Die Mindestanforderung für Standardkurve Generation ist die Messung von zwei Normen oder die Messung der Null-Referenz und mindestens ein Standard. Es wird empfohlen, zusätzliche Standards wie nötig, um die erwarteten Assaykonzentration abdecken einbezogen werden.
  3. Stellen Sie eine leere. Der Rohling für kolorimetrische Assays ist in der Regel H 2 O. deionisiertem
  4. Pipette 2 &mgr; l dH 2 O auf den Boden Sockel, senken Sie den Arm aus und klicken Sie Blank. Nur eine leere ist notwendig, um alle nachfolgenden Messungen der Referenz-und-Standards abdecken.
  5. Stellen Sie die Referenz durch Pipettieren einer 2 ul-Aliquot, die nur arbeiten Reagenz und Puffer ohne Protein auf den unteren Sockel. Senken Sie den Arm aus und klicken Sie messen.
  6. Unter der Standards Registerkarte, markieren Sie den gewünschten Standard und Pipette 2 ul der gewünschten Norm auf den unteren Sockel. Senken Sie den Arm aus und klicken Sie messen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Standards. Achten Sie darauf, alle Standards vor Maßnahme zur Messung von Proben. Um Standardkurve klicken Sie auf Standard-Kurve.

d. Mikrovolumen BCA Assay Messungen 2 ul Protein-Messungen

  1. Nach all den Standards gemessen worden sind, auf die Proben-Button. Geben Sie die Proben-ID. Last 2 ul der Probe auf die untere Sockel und klicken Sie auf Messen. Ein frisches 2 ul-Aliquot der Probe sollte für jede Messung verwendet werden.
  2. Wischen Sie die Probe aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen.

e. Mikrovolumen BCA Assay Messungen Reinigung und Wiederaufbereitung

Führen Sie die Reinigung und Instandsetzung in der direkten A280 Absorptionsmessungen beschrieben.

Repräsentative Ergebnisse:

Mikrovolumen Proteinkonzentration Bestimmung wird entweder durch eine direkte Messung A280 oder eine indirekte kolorimetrische Assay durchgeführt. Die A280-Messung beispielsweise bestimmt Proteinkonzentration auf die Extinktionskoeffizienten des Proteins von Interesse sind. Die BCA Farbtestverfahren Beispiel wird bestimmt, Proteinkonzentration einer Standardkurve mit bekannten Protein-Konzentrationen auf.

Discussion

Mikrovolumen Quantifizierung verwendet die intrinsische Oberflächenspannung Eigenschaften einer Probe zu einer Flüssigkeitssäule zwischen zwei Messflächen bilden. Das Fehlen eines Containment-Gerät ermöglicht die Weglänge, um in Echtzeit zu ändern, im Wesentlichen entfällt die Notwendigkeit, Verdünnungen durchzuführen. Diese Fähigkeit erhöht drastisch die Dynamik von Protein-Konzentrationen sowie die Schnelligkeit der Messung. Durch die Verwendung von minimalen Mengen der Probe, kann eine große Anzahl von Proben schnell und genau analysiert werden, so dass die Wissenschaftler mehr Messungen und eine bessere Qualitätskontrolle. Darüber hinaus, und wenn nötig, können wertvolle Proben nach der Messung zurückgewonnen werden. Wenn solche kleinen Volumina gemessen werden, ist Probenhomogenität äußerst wichtig, Stichprobenfehler zu vermeiden. Low Retention Pipettenspitzen sollte immer zum Laden Proben verwendet werden und die Spitzen sollte geändert werden zwischen Probe repliziert werden. Der Sockel Flächen müssen ordnungsgemäß gereinigt und aufbereitet, um die genauesten Ergebnisse zu gewährleisten. Schließlich ist die Mikrovolumens Spektrophotometer ideal ist, wenn Probe ist jedoch begrenzt, um die Einfachheit der Nutzung, Geschwindigkeit und umfangreichen Dynamikbereich des Spektrometers ist geeignet, wenn Probe reichlich ist.

Disclosures

Die Autoren sind Mitarbeiter von Thermo Fisher Scientific, dass Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

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References

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  4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
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Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer
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Cite this Article

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

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