Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

דגימות Microvolume הם לכמת ידי מערכת ספקטרופוטומטר המשתמשת מתח הפנים הטבעי לשמור דגימות ללא שימוש cuvettes או נימים. טווח דינמי של ריכוזי חלבון מהירות שבה הם יכולים להימדד הם גדל מאוד בשיטה זו.

Abstract

לספקטרופוטומטריה מסורתית דורשת הצבת דגימות לתוך cuvettes או נימים. זה בדרך כלל לא מעשי בשל כרכים מדגם מוגבל לעתים קרובות לניתוח חלבונים. המדעית Thermo NanoDrop 2000c ספקטרופוטומטר פותרת בעיה זו באמצעות מערכת שימור חדשנית מדגם המכיל דגימות microvolume בין שני משטחים מדידת מתח פנים באמצעות תכונות של נוזלים, המאפשר כימות של דגימות בכמויות נמוכות ככל μL 0.5-2. חיסול cuvettes או נימים מאפשר שינויים בזמן אמת אורך הדרך, אשר מפחית את זמן המדידה תוך הוגדל הטווח הדינאמי של ריכוזי חלבון זה ניתנת למדידה. הצורך דילולים מסולק גם, ההכנות כימות מדגם קל יחסית כמו משטחי מדידה יכול להימחק פשוט עם מעבדה לנגב. מאמר זה מציג וידאו שינויים בשיטות מסורתיות ריכוז חלבון נחישות עבור כימות של כמויות microvolume של חלבון באמצעות A280 קריאות ספיגת או assay colorimetric BCA.

Protocol

I. 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

הטכנולוגיה NanoDrop מבוסס על מערכת שימור חדשנית מדגם המשתמשת מתח הפנים להחזיק למדוד דגימות microvolume בין שני כנים אופטי ללא שימוש cuvettes או נימים. 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר משתמשת בטכנולוגיה זו כדי למדוד בקלות ובמהירות 0.5-2 טיפות μL של חלבונים, DNA, RNA, ביומולקולות אחרים. יכולת זו הפך חשוב יותר ויותר בטכניקות מולקולריות להתפתח ללא הרף להשתמש בכמויות קטנות של החומר לניתוח. האידיאל ספקטרופוטומטר microvolume התנאים שבהם מדגם מוגבל. עם זאת, קלות השימוש, מחזור מדידה מהיר, טווח הריכוז נרחב גם להפוך ספקטרופוטומטר המתאים כאשר כמויות גדולות של מדגם זמינים. מחזור המדידה היא גם הקטינה באופן משמעותי, מסייעים למדענים ברחבי workflows להגביר את היעילות שלהם.

Microsample ממוקם ישירות על גבי משטח איתור טור נוזל נוצר בין הקצוות של סיבים אופטיים על ידי מתח הפנים. זה טור נוזל צורות נתיב אופטי אנכי. פלאש קסנון מנורה מספק את מקור האור ספקטרומטר ניצול מערך ליניארי CCD משמש כדי לנתח את האור שעובר דרך המדגם.

הסרת התקנים ההכלה המסורתית כגון cuvettes מהמערכת יש מספר יתרונות: כמויות קטנות מאוד של המדגם יש צורך מדידה, ניקוי פשוט דורש לנגב את משטחי אופטי עם מעבדה לנגב, ואת אורך הדרך ניתן לשנות בזמן אמת במהלך המדידה.

2000c NanoDrop קובע את אורך מסלול אופטימלי אוטומטית (1 מ"מ עד 0.05 מ"מ), מתן מגוון רחב ביותר של מדידות ריכוז חלבון אפשרי בלי דילולים. על ידי קיצור אורך הדרך, ריכוזים גבוהים יותר של החלבון ניתן למדוד. פעולה זו מסירה ביעילות את הצורך לבצע דילולים עבור דגימות חלבון ביותר. לדוגמה, 2000c NanoDrop יכולים למדוד ריכוזי BSA גבוה ככל 400 מ"ג / מ"ל.

2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר הוא ספקטרופוטומטר ספקטרום מלא למדידת ספיגת של DNA, RNA, חלבונים, ביומולקולות אחרים. זה פרוטוקול וידאו תתמקד המדידה של חלבונים.

השנייה. ריכוז חלבון Microvolume קביעת שימוש A280 מדידות ספיגת

א עקרון A280 מדידות

השיטה A280 חלבון ישים מטוהרים חלבונים המכילים טריפטופן, טירוזין, פנילאלנין או שאריות ציסטאין-ציסטאין אג"ח disulphide ואת ספיגת בתערוכה 280 ננומטר. שיטה זו משתמשת בערך A280 ספיגת בשילוב עם או מקדם הכחדה המונית או מקדם הכחדה טוחנת כדי לחשב את הריכוז של חלבון מטוהרים. היתרון של A280 מדידה ישירה היא שהדור של עקומת סטנדרט אינה נדרשת כדי לקבוע ריכוז החלבון. אם המדגם הוא פתרון חלבון uncharacterized, lysate התא, או לחלץ חלבון גולמי, לאחר מכן באמצעות אחד מוגדר מראש שיטות colorimetric זמין על 2000/2000c NanoDrop, כגון BCA, פירס 660 ננומטר, ברדפורד, מבחני לורי, היא מומלץ.

ב Microvolume חלבון A280 מדידות - אתחול

  1. בחר את היישום A280 חלבון מהתפריט הראשי.
  2. בחר את סוג המדגם כדי להימדד מהרשימה הנפתחת. הגדרת ברירת המחדל היא המומלצת ביותר תערובות חלבון ידוע שבו Abs 1 = 1 מ"ג / מ"ל. אם מדידת חלבון מזוכך מאופיין בעבר, אז גם ההכחדה ההמונית מקדם או מקדם הכחדה טוחנת ועל משקל מולקולרי ניתן להזין על מנת לקבוע את ריכוז החלבון באופן מדויק יותר.
  3. בחר את יחידות הריכוז מהרשימה הנפתחת.

ג A280 Microvolume חלבון מדידות - blanking

  1. הקמת ריק באמצעות המאגר המתאים. חשוב להשתמש חיץ שבו החלבון הוא מושעה. המאגר משמש את ה-pH צריך להיות אותו כוח יוניים דומה כפתרון המדגם. הערה: מאגרים Ripa לתרום ספיגת יותר מדי על 280 ננומטר ולכן הם בקנה אחד עם מדידות חלבון ישיר A280. עבור חלבונים המרחפים חיץ Ripa, מומלץ ריכוז חלבון ייקבע באמצעות חיץ תואם Ripa assay colorimetric.
  2. פיפטה 2 μL הפתרון המתאים blanking על הדום התחתונה, להוריד את היד ולחץ על ריק.
  3. נגבו את הפתרון ריק מן כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב.

ד A280 Microvolume חלבון מדידות מדידת

שיקולים חשוב: ההומוגניות של המדגם הוא מאודחשוב מאז נפח קטן כזה נמדדת. על מנת להבטיח כי הדגימות הן הומוגניות, בעדינות אך ביסודיות לערבב את דגימות מייד לפני נטילת aliquot למדידה. הימנע מציגה בועות כאשר ערבוב pipetting.

בשל השתנות של מתח הפנים בין חלבונים שונים, אנו ממליצים טעינת 2 μL של דגימות כדי להבטיח בטור המתאים. השתמש תמיד נמוך טפטפת טיפים השמירה. כדי לטעון מדגם, גע עם קצה פיפטה אל פני השטח הדום אופטי נמוכה תוך גירוש פתרון כדי למנוע את הפתרון מתוך דבקות החיצוני של קצה פיפטה. לגרש פחות הסכום המלא של המדגם כדי למנוע את ההתפרצות מבוא של בועות במדגם.

  1. הזן מזהה מדגם בשדה המתאים, לטעון 2 μL של המדגם הראשון כמתואר עבור מדוד את ריק ולחץ. Aliquot 2μL טרי המדגם אמור לשמש עבור כל מדידה.
  2. הסר את הדוגמה כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב.

ה Microvolume חלבון A280 מדידות ניקוי

רגילה, נטולת סיבים, במעבדה לנגב הוא לעתים קרובות מספיק לניקוי כנים אופטי בין המדידות.

ו ביצוע מדידות A280 חלבון שפוץ

פתרונות ריאגנטים המכיל חומרים פעילי שטח יכול uncondition את הכן משטחי מדידה לאורך זמן, למנוע את עמודת נוזל דוגמת הטופס. השטחת אגל על ​​כן התחתונה מעיד על המשטח האופטי להיות מותנית. אם מאפייני פני השטח נפרץ, שפוץ כנים חשוב לוודא טור היווצרות המדגם. במקרה זה, בעירום משטחים אופטיים למחות נמרצות באמצעות מעבדה או להשתמש במגרש Pedestal NanoDrop שפוץ (PR-1) על פי ההנחיות.

ג. Microvolume ריכוז חלבון באמצעות קביעת מבחני Colorimetric

א עקרון הגילוי colorimetric

ספקטרופוטומטר 2000c NanoDrop יכול לשמש גם כדי למדוד פתרונות חלבון uncharacterized, lysates תא, תמציות חלבון גולמי באמצעות מבחני colorimetric.

שיטות Colorimetric שיטות עקיפות הכרוכות האינטראקציה של צבע עם למרכיב החלבוני של המדגם כדי לייצר מורכבות חדשה סופג אור בטווח אורך גל הנראה.

ספקטרופוטומטר 2000c NanoDrop יש מספר מוגדר מראש מבחני colorimetric כולל BCA, פירס 660, ברדפורד, ושיטות לורי. Assay BCA יהיה הפגינו כמו assay דוגמה colorimetric באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume. (צילום מסך)

Assay (חומצה Bicinchoninic) BCA היא שיטה colorimetric נפוץ המשמש לעתים קרובות לפתרונות חלבון וחלבונים לדלל בנוכחותם של רכיבי כי יש ספיגת UV משמעותית (280 ננומטר). בניגוד לשיטה A280 חלבון, שיטת חלבון BCA דורש עקומת סטנדרט להיווצר לפני חלבון ריכוזי מדגם ניתן למדוד.

השיטה משתמשת חומצה bicinchoninic (BCA) כמו מגיב לגילוי. CU-BCA Chelate נוצרו בנוכחות חלבון נמדד ב 562 ננומטר מנורמל ב 750 ננומטר.

ב Microvolume BCA מדידות Assay BCA הכנה Assay

  1. ריאגנטים הנדרש כלולים בערכה סוכן הפחתת תואם (Thermo Scientific חתול פירס לא 23250..): מגיב BCA A, B BCA מגיב, מגיב תאימות, חיץ הכינון, ו אלבומין (BSA) סטנדרטים.
  2. לאזן את כל החלבונים ידוע סטנדרטים חלבון לטמפרטורת החדר ומערבבים היטב.
  3. הכינו מספיק מגיב עובד טרי הסטנדרטים דגימות כדי להימדד באמצעות יחס של 50:1 מגיב: B
  4. עבור assay המיקרו, השתמש יחס של 1:01 מגיב הפועלים המדגם. הוסף 10 μL לעבוד מגיב על צינור אחד עם צינורות מספיק כדי לכסות את כל דגימות סטנדרטים. עבור assay גבוהה בטווח, השתמש יחס של 20:01 מגיב הפועלים המדגם. הוספת 190 μL לעבוד מגיב על צינור אחד עם צינורות מספיק כדי לכסות את כל דגימות סטנדרטים. עיין BCA פירס ערכת ספרות כדי לקבוע איזה יחס מתאים דגימות שלך.
  5. הוסף 10 μL של תקן או מדגם צינור שכל אחת מהן מכילה מגיב. מערבבים היטב על ידי בעדינות vortexing.
  6. דגירה הצינורות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  7. אפשר תגובות לאזן לטמפרטורת החדר (~ 10 דקות).

ג Microvolume BCA מדידות Assay יצירת Curve רגילה

  1. בחר את שיטת חלבון BCA מהתפריט הראשי. אם החלון אימות גל מופיע, להבטיח הזרוע היא כלפי מטה.
  2. הזן את הערכים עבור כל הריכוז תקן בטבלה החלונית השמאלית. התוכנה מאפשרת עבור ההפניה ועד 7 additסטנדרטים לאומיים. וההפניה / או סטנדרטים צריך להימדד משכפל.
    הערה: הדרישה המינימלית עבור הדור עקומת הסטנדרטי הוא המדידה של שני סטנדרטים או מדידת ההתייחסות אפס אחד לפחות סטנדרטי. מומלץ תקנים נוספים שייכללו לפי הצורך כדי לכסות את הריכוז הצפוי בטווח assay.
  3. הקמת ריק. ריק עבור מבחני colorimetric הוא deionized בדרך כלל H 2 O.
  4. פיפטה 2 μL של DH 2 O על הדום התחתונה, להוריד את היד ולחץ על ריק. רק אחד ריק יש צורך לכסות את כל המדידות הבאות של הפניה סטנדרטים.
  5. להקים את הפניה על ידי pipetting aliquot 2 μL המכיל רק מגיב עבודה חיץ עם חלבון לא על רגל התחתון. מנמיכים את הזרוע למדוד לחץ.
  6. בכרטיסייה התקנים, לסמן את רמת המבוקש פיפטה 2 μL ברמה הרצויה על בסיס התחתון. מנמיכים את הזרוע למדוד לחץ. חזור על התהליך עבור כל הסטנדרטים. הקפד למדוד את כל הסטנדרטים לפני דגימות מדידה. כדי להציג את עקומת סטנדרט לחץ צפה Curve רגיל.

ד Microvolume BCA מדידות Assay 2 מדידות חלבון μL

  1. אחרי כל התקנים נמדדו, לחץ על הכפתור דוגמאות. הזן את מזהה המדגם. טען 2 μL של המדגם על המעמד התחתון לחץ מדוד. Aliquot טרי 2 μL המדגם אמור לשמש עבור כל מדידה.
  2. נגבו את הדוגמה כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב.

ה Microvolume מדידות BCA Assay ניקוי שפוץ

בצע ניקוי שפוץ כמתואר A280 מדידות ישירות ספיגת.

נציג תוצאות:

ריכוז Microvolume נחישות חלבון מתבצע על ידי מדידה או A280 ישיר או עקיף assay colorimetric. הדוגמה A280 המדידה קובעת ריכוז חלבון על בסיס מקדם הכחדה של החלבון של עניין. הדוגמה colorimetric BCA assay קובע ריכוז חלבון מבוססת של עקומת תקן של ריכוזי חלבון ידועים.

Discussion

Quantitation Microvolume משתמש המתח הפנימי משטח המאפיינים של מדגם כדי ליצור עמודה נוזל בין שני משטחים המדידה. היעדר של התקן בלימה, המאפשר אורך הדרך לשנות בזמן אמת, למעשה מבטל את הצורך לבצע דילולים. יכולת זו מגדילה באופן דרמטי את הטווח הדינמי של ריכוזי חלבון, כמו גם את מהירות המדידה. באמצעות כמויות מינימליות של המדגם, מספר רב של דוגמאות ניתן לנתח במהירות ובאופן מדויק, מאפשרת למדענים לבצע מדידות יותר להשיג שליטה באיכות טובה יותר. בנוסף, ובמידת הצורך, דגימות יקרות ניתן לשחזר לאחר לקיחת המדידה. כאשר בנפחים קטנים כאלה נמדדים, מדגם הומוגניות הוא מאוד חשוב כדי למנוע טעויות דגימה. נמוכה פיפטה טיפים שמירה תמיד צריך לשמש עבור דגימות העמסה את הטיפים צריך להיות שונה בין מדגם משכפל. משטחים הדום יש לנקות כראוי מותנה כדי להבטיח את התוצאות המדויקות ביותר. לבסוף, ספקטרופוטומטר microvolume הוא אידיאלי כאשר המדגם הוא מוגבל, לעומת זאת, קלות שימוש, מהירות, טווח דינמי רחב של הספקטרומטר להפוך אותו מתאים כאשר המדגם הוא בשפע.

Disclosures

המחברים הם עובדים של תרמו פישר סיינטיפיק המייצרת ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. (1996).
  2. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  5. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. (2006).
  6. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  7. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).
ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter