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Biology

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

Microvolume 샘플 cuvettes이나 모세 혈관의 사용없이 샘플을 유지하기 위해 천연 표면 장력을 사용하는 분광 광도계 시스템 계량입니다. 그들이 측정 수있는 단백질 농도와 속도의 동적 범위는 크게이 방법으로 증가하고 있습니다.

Abstract

전통 분광 광도법은 cuvettes이나 모세 혈관에 샘플을 배치해야합니다. 이것은 종종 인해 종종 단백질 분석에 사용되는 제한된 샘플 볼륨을 모르시는 것입니다. 써모 과학 NanoDrop 2000c 분광은 0.5-2 μL으로 낮은 볼륨의 샘플 부량를 활성화, 액체의 표면 장력 특성을 사용하여 두 측정 표면 사이 microvolume 샘플을 보유하고 혁신적인 샘플 유지 시스템과 함께이 문제를 해결합니다. cuvettes이나 모세 혈관의 제거는 크게 측정할 수 단백질 농도의 동적 범위를 증가하는 동안 측정 시간을 단축 경로의 길이는 실시간으로 변경을하실 수 있습니다. dilutions에 대한 필요도 제거하고, 측정 표면은 단순히 무기를 닦아와 함께 닦아 수 있듯이 샘플 부량 준비는 비교적 간단합니다. 이 동영상이 문서에서는 A280 흡광도 수치 또는 BCA colorimetric 분석을 사용하여 단백질의 microvolume 금액의 부량 전통 단백질 농도 결정 방법 수정 사항을 제공합니다.

Protocol

I. NanoDrop 2000c 분광

NanoDrop 기술 cuvettes 또는 모세 혈관의 사용없이 2 광학 받침대 사이 microvolume 샘플을 보유하고 측정하는 표면 장력을 사용하는 혁신적인 샘플 유지 시스템을 기반으로합니다. NanoDrop 2000c 분광 광도계는 빠르고 쉽게 0.5-2 단백질 μL 방울, DNA, RNA 및 기타 biomolecules을 측정하기 위해이 기술을 사용합니다. 분자 기법을 지속적으로 분석 물질의 작은 금액을 사용하는 발전으로이 기능은 점점 더 중요 해지고있다. 샘플이 제한되는 조건에 대한 microvolume 분광 광도계의 이상적. 시료의 충분한 양을 사용할 때 그러나 쉬운의 사용, 빠른 측정주기와, 그리고 다양한 농도 범위는 또한 분광 광도계가 적합합니다. 측정주기는 크게 과학자들이 자신의 워크플로우 전반에 걸쳐 효율성을 높이는 데 도움이 줄어 듭니다.

microsample는 감지 표면 위에 직접 위치하고 있으며 액체 열은 표면 장력에 의해 광섬유의 끝부분 사이에 생성됩니다. 이 액체 열은 수직 광 경로를 형성한다. 크세논 플래시 램프는 광원과 선형 CCD 배열이 시료를 통과 빛을 분석하는 데 사용됩니다 활용 분광계를 제공합니다.

시스템에서 같은 cuvettes 전통 억제 장치를 제거하면 몇 가지 장점이 있습니다 : 샘플의 매우 작은 양의 측정을 위해 필요한, ​​청소는 단순히 무기를 닦아와 광학 표면을 닦아 내고 필요로하고, 경로 길이가 측정하는 동안 실시간으로 변경할 수 있습니다.

NanoDrop 2000c는 dilutions없이 가능한 단백질 농도 측정의 가장 광범위한 범위를 제공 (1 mm까지 0.05 ㎜) 자동으로 최적의 경로 길이를 결정합니다. 경로 길이를 단축함으로써, 단백질의 높은 농도는 측정할 수 있습니다. 이것은 효과적으로 대부분의 단백질 샘플 dilutions을 수행하기 위해 필요를 제거합니다. 예를 들어, NanoDrop 2000c 400 MG / ML만큼 높은 BSA의 농도를 측정할 수 있습니다.

NanoDrop 2000c 분광은 DNA, RNA, 단백질 및 기타 biomolecules의 흡광도를 측정하는 전체 스펙트럼 분광 광도계이다. 이 비디오 프로토콜은 단백질의 측정에 초점을 맞출 것이다.

II. A280 흡광도 측정을 사용하여 Microvolume 단백질 농도 결정

A. A280 측정 원리

단백질 A280 방법은 280 nm의에서 트립토판, 티로신, 페닐알라닌 잔류물 또는 시스테인 - 시스테인 disulphide 채권 및 전시 흡광도를 포함하는 단백질을 정화하기 위해 적용됩니다. 이 방법은 정화 단백질의 농도를 계산하기 위해 대량 멸종 계수 또는 어금니 흡광 계수 중 하나와 함께 A280 흡광도 값을 사용합니다. 직접 A280 측정의 장점은 표준 곡선의 생성이 단백질 농도를 결정하기 위해 필요하지 않습니다 것입니다. 샘플 uncharacterized 단백질 솔루션, 휴대 lysate, 또는 조잡한 단백질 추출물 경우, 다음과 같은 BCA, 피어스 660 NM, 브래드 포드, 그리고 로리 assays로 NanoDrop 2000/2000c에서 사용할 수있는 미리 구성된 colorimetric 방법 중 하나입니다 사용 좋습니다.

B. Microvolume 단백질 A280 측정 - 시작

  1. 주 메뉴에서 단백질 A280 응용 프로그램을 선택합니다.
  2. 드롭 다운 목록에서 측정 샘플의 유형을 선택합니다. 기본 설정은 대부분의 알려지지 않은 단백질 혼합물있는 1 애비 = 1 MG / ML. 권장합니다 이전 특징 정화 단백질을 측정하는 경우에는 대량 멸종 계수 또는 어금니 흡광 계수와 분자량도 더 정확하게 단백질 농도를 결정하기 위해 입력할 수 있습니다.
  3. 드롭 다운 목록에서 농도 단위를 선택합니다.

C. Microvolume 단백질 A280 측정 - 블랭킹

  1. 적절한 버퍼를 사용하여 빈을 설정합니다. 단백질이 정지되는 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다. 사용되는 버퍼 같은 산도 및 샘플 솔루션으로 비슷한 이온 강도의해야합니다. 참고 : 리파 버퍼는 280 nm의 흡광도에서 너무 많이 기여하고 따라서 직접 A280 단백질 측정과 호환되지 않습니다. 리파 버퍼에 일시 중지 단백질의 경우, 그것은 단백질 농도가 리파 버퍼 호환 colorimetric 분석을 사용하여 결정하는 것이 좋습니다.
  2. 하단 받침대에 해당 블랭킹 솔루션의 피펫 2 μL은 팔을 절감하고 빈을 클릭합니다.
  3. 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 빈 솔루션을 닦아주십시오.

D. 측정 Microvolume 단백질 A280 측정

중요 고려 사항 : 샘플의 균질성은 매우있다이러한 작은 볼륨부터 중요한이 측정되고있다. 부드럽게, 샘플 동질적인 것을 보장하지만 철저하게 측정 나누어지는을 복용하기 전에 즉시 샘플을 혼합합니다. 혼합 및 pipetting 할 때 거품을 도입하지 마십시오.

다른 단백질 사이의 표면 장력의 변화로 인해, 우리는 적절한 열 형성을 위해 샘플을 2 μL를 로드할 것을 권장합니다. 낮은 유지 피펫 팁을 항상 사용합니다. 피펫 팁의 외부로 준수의 솔루션을 방지하기 위해 솔루션을 추방하면서 샘플을로드하려면, 아래 광학 받침대 표면에 피펫 팁을 터치. 폭발 및 샘플의 거품의 도입을 방지하기 위해 샘플의 전체 금액보다 적은 금액을 추방.

  1. 해당 필드에 샘플 ID를 입력 빈을 클릭 법안에 대한 설명으로 첫 번째 예제 2 μL를로드합니다. 시료의 신선한 2μL 나누어지는 각 측정에 사용해야합니다.
  2. 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 샘플을 제거합니다.

E. 청소 Microvolume 단백질 A280 측정

일반 보푸라기가없는, 실험실 닦아 자주 측정 사이의 광학 받침대 청소 충분합니다.

F. Reconditioning 단백질 A280 측정 만들기

계면 활성제를 포함하는 솔루션 및 시약은 양식 샘플 액체 열 방지, 시간이 지남에 따라 측정 페데 스탈 표면을 uncondition 수 있습니다. 하단 받침대에있는 비말의 평평화은 광학 표면이 무조건 될 나타내는 것입니다. 표면 특성에 문제가있다면, 받침대를 reconditioning하면 샘플 열 형성을 보장하는 것이 중요합니다. 이 문제가 발생하면 털많은 적극적으로 실험실 닦아 또는 지시대로 (PR - 1) NanoDrop 받침대 Reconditioning 컴파 운드를 사용을 사용하여 광학 표면.

III. Colorimetric Assays를 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

A. colorimetric 검출의 원리

NanoDrop 2000c 분광 광도계는 colorimetric assays를 사용하여 uncharacterized 단백질 솔루션, 세포 lysates, 그리고 원유 단백질 추출물을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

Colorimetric 방법은 보이는 파장 범위의 빛을 흡수하는 새로운 복합을 생산하기 위해 샘플의 단백질 구성 요소와 염료의 상호 작용을 포함 간접 방법입니다.

NanoDrop 2000c 분광 광도계는 BCA, 피어스 660, 브래드 포드, 그리고 로리 방법 등 여러 가지 사전 구성된 colorimetric assays 있습니다. BCA의 분석은 microvolume 분광 광도계를 사용하여 예제 colorimetric 분석으로 입증됩니다. (스크린샷)

BCA (Bicinchoninic의 산성) 분석은 종종 중요한 UV (280 nm의) 흡광도를 구성 요소의 존재에 희석 단백질 솔루션 및 단백질에 사용되는 일반적인 colorimetric 방법입니다. 단백질 A280 방법과는 달리 단백질 BCA 방법은 샘플의 단백질 농도를 측정하기 전에 표준 곡선이 생성되어야합니다.

방법은 검출 시약으로 bicinchoninic 산성 (BCA)를 사용합니다. 단백질의 존재에 형성 잘라내기 - BCA 킬레이트는 562 nm의에서 측정하여 750 nm의에 정상화됩니다.

B. Microvolume BCA 분석 측정 BCA 분석 준비

  1. BCA 시약, BCA 시약의 B, 호환성 시약, Reconstitution 버퍼, 그리고 알부민 (BSA) 기준 : 필요한 시약은 감소 에이전트 호환 키트 (.. 써모 과학 피어스 고양이도 23250)에 포함되어 있습니다.
  2. 상온의 모든 미지의 단백질과 단백질 수준을 평형 철저히 섞는다.
  3. 시약의 5​​0:1 비율을 사용하여 표준과 측정에 샘플을 충분히 신선한 작업 시약 준비 : B
  4. 마이크로 분석을 위해, 샘플 위해 노력 시약의 1:1 비율을 사용합니다. 모든 샘플과 표준을 감추기에 충분 할만큼 튜브를 각 튜브에 시약을 조사하고 10 μL를 추가합니다. 높은 범위 분석의 경우, 샘플 위해 노력 시약의 20시 1분 비율을 사용합니다. 모든 샘플과 표준을 감추기에 충분 할만큼 튜브를 각 튜브에 시약을 조사하고 190 μL를 추가합니다. 귀하의 샘플에 적합하는 비율 결정하는 피어스 BCA 키트 문학을 참조하십시오.
  5. 시약을 포함하는 각각의 튜브에 표준 또는 샘플 10 μL를 추가합니다. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다.
  6. 37 튜브를 품어 ° C를 30 분.
  7. 반응이 실온 (~ 10 분) 평형 수 있습니다.

C. 표준 곡선을 생성 Microvolume BCA 분석 측정

  1. 주 메뉴에서 단백질 BCA 방법을 선택합니다. 파장 확인 창이 나타나면, 팔을 아래로 있는지 확인하십시오.
  2. 오른쪽 창에서 테이블에있는 각 표준 농도에 대한 값을 입력합니다. 이 소프트웨어는 참조 최대 7 addit을 허용ional 기준. 참조 및 / 또는 표준 복제로 측정해야합니다.
    참고 : 표준 곡선 생성을위한 최소 요구 사항이 두 표준의 측정 또는 제로 참조와 하나 이상의 표준의 측정이다. 그것은 추가적인 기준은 예상 분석 농도 범위를 커버하기 위해 필요한 포함하는 것이 좋습니다.
  3. 빈을 설정합니다. colorimetric assays에 대한 공백은 일반적으로 H 2 O.을 deionized입니다
  4. 하단 받침대에 DH 2 O의 피펫 2 μL은 팔을 절감하고 빈을 클릭합니다. 단 한 빈은 참조 및 표준의 모든 후속 측정을 충당하기 위해 필요합니다.
  5. 하단 받침대에 단백질에만 작업 시약 및 버퍼를 포함하는 2 μL 나누어지는을 pipetting하여 참조를 설정합니다. 팔과 클릭 법안을 낮추십시오.
  6. 표준 탭에서 하단 받침대에 원하는 표준의 원하는 표준 및 피펫 2 μL를 강조 표시합니다. 팔과 클릭 법안을 낮추십시오. 모든 표준에 대한 과정을 반복합니다. 측정 샘플을하기 전에 모든 기준을 측정해야합니다. 표준 곡선을 보려면하면 표준 곡선보기를 누릅니다.

D. Microvolume BCA 분석 측정 2 μL 단백질 측정 할

  1. 표준의 모든 측정되었습니다 후 샘플 버튼을 클릭합니다. 샘플 ID를 입력하십시오. 하단 받침대에 시료 2 μL를로드하고 법안을 클릭합니다. 시료의 신선한 2 μL 나누어지는 각 측정에 사용해야합니다.
  2. 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 샘플을 닦아주십시오.

E. Microvolume BCA 분석 측정 청소 및 Reconditioning

청소와 직접 A280 흡광도 측정에서 설명한대로 reconditioning을 수행합니다.

대표 결과 :

Microvolume 단백질 농도 결정은 직접 A280 측정 또는 간접적 colorimetric 분석에 의해 수행됩니다. A280 측정 예제는 관심의 단백질의 흡광 계수에 따라 단백질 농도를 결정합니다. BCA colorimetric 분석 예제는 알려진 단백질 농도의 표준 곡선을 기반으로 단백질 농도를 결정합니다.

Discussion

Microvolume의 quantitation 두 측정 표면 사이에 액체 열을 형성하는 샘플의 내장 표면 장력 속성을 사용합니다. 억제 장치의 부재는 경로 길이는 본질적으로 dilutions을 수행하기 위해 않아도, 실시간으로 변경할 수 있습니다. 이 기능은 대폭 단백질 농도의 동적 범위뿐만 아니라 측정의 속도를 증가시킵니다. 시료의 최소 금액을 사용하여 샘​​플의 큰 숫자는 과학자들이 더 많은 측정을하고 더 나은 품질 관리를 달성할 수 있도록 신속하고 정확하게 분석할 수 있습니다. 또한, 필요한 경우, 소중한 샘플은 측정을 복용 후 복구할 수 있습니다. 이러한 작은 볼륨 측정되는 경우, 샘플 균질성은 샘플링 오류를 피하기 위해 매우 중요합니다. 낮은 유지 피펫 팁 항상 로딩 샘플 사용해야하고 예제 복제 사이의 팁을 변경해야합니다. 페데 스탈 표면이 제대로 청소하고 가장 정확한 결과를 보장하기 위해 냉방해야합니다. 샘플이 제한되었을 때 마지막으로, microvolume 분광 광도계가 이상적입니다, 그러나 쉬운의 사용, 속도 및 분광계의 광범위한 다이나믹 범위는 샘플이 풍부한 경우가 적합합니다.

Disclosures

저자는이 문서에서 사용하는 시약 및 도구를 만들어 써모 피셔 사이 언티픽의 직원입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

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References

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Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

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