Summary
Microvolume prover kvantifieras av en spektrofotometer som använder naturliga ytspänning att behålla prover utan användning av kyvetter eller kapillärer. Det dynamiska omfånget av protein koncentrationer och hastighet som de kan mätas är kraftigt ökat med denna metod.
Abstract
Traditionella spektrofotometriskt kräver att placera prover i kyvetter eller kapillärer. Detta är ofta opraktiskt på grund av den begränsade provvolymer används ofta för protein analys. Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spektrofotometer löser problemet med ett innovativt urval behålla systemet som håller microvolume prov mellan två mätningar ytor med hjälp av egenskaperna ytspänning av vätskor, vilket möjliggör kvantifiering av proverna i volym så lågt som 0,5 till 2 mikroliter. Elimineringen av kyvetter eller kapillärer ger realtid förändringar i längd, vilket minskar mättiden samtidigt kraftigt öka det dynamiska omfånget av protein koncentrationer som kan mätas. Behovet av spädningar är också elimineras, och förberedelser för prov kvantifiering är relativt lätta på mätning ytor kan enkelt torkas av med laboratorium torka. Denna video artikeln presenteras ändringar av traditionella beslutsamhet proteinkoncentrationen metoder för kvantifiering av microvolume mängder protein använda A280 absorbansmätningar eller BCA kolorimetrisk analys.
Protocol
I. NanoDrop 2000c Spektrofotometer
NanoDrop Tekniken bygger på en innovativ prov retention system som utnyttjar den ytspänning att hålla och mäta microvolume prover mellan två optiska piedestaler utan användning av kyvetter eller kapillärer. Den NanoDrop 2000C spektrofotometern använder denna teknik för att snabbt och enkelt mäta 0,5-2 mikroliter droppar av proteiner, DNA, RNA och andra biomolekyler. Denna funktion har blivit allt viktigare som molekylära tekniker ständigt utvecklas för att använda mindre mängder material för analys. Den microvolume spektrofotometer idealiska för förhållanden som provet är begränsat. Men lätt att använda, snabb mätning cykel och och omfattande koncentrationsintervall gör också spektrofotometerns lämplig när rikliga mängder av prov finns tillgängliga. Mätningen cykel är också mycket mindre och hjälpa forskare att öka effektiviteten under hela deras arbetsflöden.
Den mikroprovcellen placeras direkt ovanpå upptäckt yta och en vätska kolumn skapas mellan ändarna av optiska fibrer av ytspänning. Denna vätska kolumnen utgör en vertikal optisk väg. Ett Xenon-blixt lampa ger ljuskälla och en spektrometer som använder en linjär CCD-array används för att analysera det ljus som passerar genom provet.
Ta bort traditionella inneslutning enheter såsom kyvetter från systemet har flera fördelar: mycket små mängder av provet behövs för mätning, rensa helt enkelt kräver att torka av optiska ytor med ett laboratorium torka, och väglängd kan ändras i realtid under mätningen.
Den NanoDrop 2000C bestämmer den optimala väglängd automatiskt (1 mm till 0,05 mm), ger den mest omfattande utbud av möjliga mätningar proteinkoncentration utan spädningar. Genom att korta längd, kan högre koncentrationer av protein mätas. Detta tar effektivt bort behovet av att utföra spädningar för de flesta protein prover. Till exempel kan de NanoDrop 2000C mått BSA halterna så höga som 400 mg / ml.
Den NanoDrop 2000C Spektrofotometer är ett fullt spektrum spektrofotometer för att mäta absorbansen av DNA, RNA, proteiner och andra biomolekyler. Denna video protokoll kommer att fokusera på mätning av proteiner.
II. Microvolume proteinkoncentration bestämningen med A280 absorbansmätningar
A. Principen om A280 Mått
Den Protein A280 Metoden används för renade proteiner som innehåller tryptofan, tyrosin, fenylalanin, rester eller Cysteine-Cysteine obligationer disulfid och uppvisar absorbansen vid 280 nm. Denna metod använder A280 absorbansvärde i kombination med antingen massan extinktionskoefficienten eller molar extinktionskoefficienten att beräkna koncentrationen av renat protein. Fördelen med direkta A280 mätningar är att produktionen av en standardkurva inte är skyldig att bestämma protein koncentration. Om provet är ett uncharacterized protein lösning, cell lysat eller råprotein extrakt, sedan använda en av de förkonfigurerade kolorimetriska metoder som finns på NanoDrop 2000/2000c som BCA, Pierce 660 nm, Bradford och Lowry analyser, är rekommenderas.
b. Microvolume Protein A280 Mått - Startup
- Välj det program Protein A280 från huvudmenyn.
- Välj den typ av prov som skall mätas från den nedrullningsbara listan. Standardinställningen rekommenderas för de flesta okänt protein blandningar i vilka en Abs = 1 mg / ml. Om att mäta en tidigare präglade renat protein, sedan antingen massan extinktionskoefficienten eller molära extinktionskoefficient och molekylvikt kan anges för att fastställa proteinkoncentrationen mer exakt.
- Välj koncentrationen enheter från listan.
C. Microvolume Protein A280 Mått - Blanking
- Upprätta en tom med en lämplig buffert. Det är viktigt att använda den buffert där proteinet avbryts. Bufferten används bör vara samma pH och av en liknande jonstyrka som provlösningen. OBS: Ripa buffertar bidrar för mycket absorbans vid 280 nm och är därför oförenlig med direkta mätningar A280 protein. För proteiner upphängd i en RIPA buffert rekommenderas det protein koncentrationen bestämmas med hjälp av en RIPA buffert kompatibel kolorimetriska analys.
- Pipettera 2 mikroliter av lämplig blanking lösningen på botten piedestal, sänk armen och på Tomt.
- Torka blindlösningen från nedre och övre piedestaler med en torr laboratorium torka.
D. Microvolume Protein A280 Mått Mätning
Viktiga överväganden: Den homogenitet provet är extremtviktigt eftersom en sådan liten volym mäts. För att säkerställa att proven är homogena, försiktigt men grundligt blanda proverna omedelbart före ta en delmängd för mätning. Undvika att införa bubblor när blandning och pipettering.
På grund av variationen i ytspänningen mellan olika proteiner, rekommenderar vi lastning 2 mikroliter av prover för att säkerställa korrekt kolumn bildas. Använd alltid låg tips retention pipett. För att ladda ett prov trycker pipettspetsen till den lägre optiska piedestal yta medan utvisa lösning för att förhindra en lösning från att fastna på utsidan av pipettspetsen. Häll mindre än det fulla beloppet av prov för att förhindra utblåsning och införande av bubblor i provet.
- Skriv in ett prov-ID i fältet, belastning 2 mikroliter av det första provet som beskrivs för den tomma och klicka på Mät. En fräsch 2μL delmängd av prov bör användas för varje mätning.
- Ta provet från den nedre och övre piedestaler med en torr laboratorium torka.
e. Microvolume Protein A280 Mått Rengöring
En vanlig, luddfri, laboratorium torka är ofta tillräckligt för att rengöra optiska piedestaler mellan mätningarna.
F. Göra Protein A280 Mått Renovering
Lösningar och reagenser som innehåller tensider kan uncondition ytorna mätningen piedestal över tiden, förebygga kolumnen prov vätskan form. En utplaning av droppen på nedre sockeln är ett tecken på den optiska ytan obetingad bli. Om ytan fastigheterna har äventyrats, rekonditionering av piedestaler är viktigt att säkerställa bildandet prov kolumn. Om detta inträffar, polera den optiska ytan kraftigt med hjälp av laboratorium torka eller använd NanoDrop sockel Renovering Compound (PR-1) enligt anvisningarna.
III. Microvolume proteinkoncentration bestämningen med Kolorimetriska analyser
A. Principen om kolorimetriska upptäckt
Den NanoDrop 2000C spektrofotometern kan också användas för att mäta uncharacterized protein lösningar, lysates cell och rå extrakt protein med kolorimetriska analyser.
Kolorimetriska metoder är indirekta metoder som innebär samverkan mellan ett färgämne med proteinet del av provet för att producera ett nytt komplex som absorberar ljus i det synliga våglängdsområdet.
Den NanoDrop 2000C spektrofotometern har flera förkonfigurerade kolorimetriska tester inkluderande BCA, Pierce 660, Bradford och Lowry metoder. BCA analysen kommer att visas som ett exempel kolorimetrisk analys med hjälp av en microvolume spektrofotometer. (Skärmdump)
BCA (Bicinchoninic Acid)-analysen är en vanlig kolorimetrisk metod som ofta används för utspädda protein lösningar och proteiner i närvaro av komponenter som har betydande UV (280 nm) absorbans. Till skillnad från den Protein A280-metoden, kräver Protein BCA metod som en standardkurva genereras före provet protein halter kan mätas.
Metoden använder bicinchoninic syra (BCA) som upptäckt reagens. Cu-BCA kelat bildas i närvaro av protein mäts vid 562 nm och normaliserade vid 750 nm.
b. Microvolume BCA analys Mått BCA analys Förberedelser
- De nödvändiga reagenser finns i reduktionsmedel kompatibel kit (Thermo Scientific Pierce katt nr 23.250..): BCA reagens A, BCA reagens B, Kompatibilitet reagens, Rekonstitution buffert, och Albumin (BSA) standarder.
- Jämvikta alla okända proteiner och normer protein till rumstemperatur och blanda väl.
- Förbered tillräckligt frisk arbetar reagens för standarder och prover som ska mätas med hjälp av ett 50:1 förhållande reagens A: B
- För mikro-analysen, använda förhållandet 1:1 arbetssätt reagens till prov. Tillsätt 10 mikroliter av att arbeta reagens till varje rör med tillräckligt tuber för att täcka alla prover och standarder. För hög-range test, använd en 20:01 förhållandet arbetar reagens till prov. Tillsätt 190 mikroliter av att arbeta reagens till varje rör med tillräckligt tuber för att täcka alla prover och standarder. Se den Pierce BCA kit litteratur för att avgöra vilken kvoten är lämplig för dina prover.
- Tillsätt 10 mikroliter av standard eller prov i varje rör innehåller reagens. Blanda väl genom att försiktigt vortexa.
- Inkubera rören vid 37 ° C i 30 minuter.
- Låt reaktionerna på rumstemperatur (~ 10 minuter).
C. Microvolume BCA analys Mått Generera standardkurva
- Välj Protein BCA-metoden från huvudmenyn. Om våglängden kontrollen visas, se till att armen är nere.
- Mata in värdena för varje standard koncentration i den högra rutan tabellen. Programvaran möjliggör för referens och upp till 7 additional standarder. Den Referens-och / eller normer skall mätas i replikat.
Obs: Minimikravet för standardkurva generation är mätning av två standarder eller mätning av noll referens och minst en standard. Det rekommenderas att ytterligare standarder ingå som nödvändig för att täcka det förväntade intervallet analysen koncentration. - Upprätta en tom. Den tomt för kolorimetriska analyser är i allmänhet avjoniserat H 2 O.
- Pipettera 2 mikroliter av dH 2 O på botten piedestal, sänk armen och på Tomt. Endast en tomt är nödvändigt för att täcka alla efterföljande mätningar av referens och standarder.
- Upprätta referensen genom att pipettera en 2 mikroliter alikvot innehållande enbart arbetar reagens och buffert utan protein på den nedre piedestal. Sänk armen och klicka på Mät.
- Under Standarder fliken markera det önskade standard och pipett 2 mikroliter av den önskade standarden på den nedre piedestal. Sänk armen och klicka på Mät. Upprepa processen för alla standarder. Var noga med att mäta alla standarder innan mäta prover. För att se standardkurvan Klicka på Visa standardkurvan.
D. Microvolume BCA analys Mått 2 mikroliter Protein Mått
- Efter alla standarder har mätts, klicka på Exempel-knappen. Skriv in provet ID. Belastning 2 mikroliter av provet på den nedre sockeln och klicka på Mät. En fräsch 2 mikroliter delmängd av prov bör användas för varje mätning.
- Torka provet från den nedre och övre piedestaler med en torr laboratorium torka.
e. Microvolume BCA analys Mått Rengöring och renovering
Utför rengöring och rekonditionering som beskrivs i den direkta A280 absorbansmätningar.
Representativa resultat:
Microvolume proteinkoncentration bestämningen utförs antingen genom en direkt A280 mätningar eller en indirekt kolorimetriska analys. Den A280 mätning exempel reglerar proteinkoncentration baserat på extinktionskoefficienten av proteinet av intresse. BCA kolorimetriska analys exempel reglerar protein-koncentrationen, på basis av en standardkurva med kända protein koncentrationer.
Discussion
Microvolume kvantifiering använder inneboende egenskaper ytspänning ett prov för att bilda en vätska spalt mellan två mätningar ytor. Avsaknaden av en anordning som tillåter väglängd att ändra i realtid, främst eliminerar behovet av att utföra spädningar. Denna funktion ökar dramatiskt det dynamiska omfånget av protein koncentrationer, liksom hastigheten på mätningen. Genom att använda minimala mängder av prov, kan ett stort antal prover analyseras snabbt och korrekt, vilket gör att forskare att ta mer mätningar och uppnå bättre kvalitetskontroll. Dessutom, och vid behov kan dyrbara prover återvinnas efter att ha tagit en mätning. När sådana små volymer mäts är provtagningsflödet homogenitet mycket viktigt att undvika urvalsfel. Låg behålla pipettspetsar ska alltid användas för proverna och tips bör ändras mellan prov replikat. Sockeln ytor skall rengöras ordentligt och betingade att se de mest korrekta resultat. Slutligen är microvolume spektrofotometern perfekt när urvalet är begränsat, dock enkel att använda, snabba och omfattande dynamiska omfånget av spektrometerns gör den lämplig när provet är riklig.
Disclosures
Författarna är anställda av Thermo Fisher Scientific som producerar reagenser och verktyg som används i denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Laboratory wipes | |||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23250 | Reducing agent compatible |
| PR-1 Reconditioning Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
References
- Aitken, A., Learmonth, M.
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J.
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C.
- Stoscheck, C. M.
