Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

الفيديو المرافقة توضح استخدام نظام التقطير GELFREE 8100 ، الذي أقسام عينات بروتين معقد على أساس الوزن الجزيئي وشفاء الكسور في المرحلة السائلة. فيديو يصف كيف تعمل هذه التكنولوجيا ، وكيف يتم استخدامها ، وتوفر البيانات الناتجة ، مع هلام بولي أكريلاميد التحليل الكهربائي للمجزأة جناسة الكبد البقري.

Abstract

نظام التقطير GELFREE 8100 هو تجزيء البروتين الرواية نظام مصمم لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش خلال تجزئة البروتين أساس الوزن الجزيئي. ويتألف النظام من استخدام واحدة ، وخراطيش قدرة 8 عينة وآلات التقطير GELFREE الفوق. خلال الفصل ، يتم تطبيق الجهد المستمر بين الأنود والكاثود الخزانات ، وتحركها electrophoretically كل خليط من البروتين حجرة التحميل الى هلام هلام العمود المصممة خصيصا. وتتركز البروتينات في الفرقة ضيق في هلام التراص ، وفصلت على أساس هذه التنقلات الكهربي منها في جل حل. كما البروتينات أزل من العمود ، انهم محاصرون وتتركز في المرحلة السائلة في الغرفة جمع وخالية من هلام. بشكل مؤقت ثم صك على فترات زمنية محددة ، ويتم جمع الكسور باستخدام ماصة. وتتكرر هذه العملية حتى الانتهاء من جمع كل الكسور المطلوب. إذا تم تشغيل عدد أقل من 8 عينات على خرطوشة ، ويمكن استخدام أي الغرف غير المستخدمة في فصل لاحق.

هذه التقنية الجديدة تسهل فصل سريعة وبسيطة لتصل إلى 8 خلائط البروتين المعقدة في وقت واحد ، ويقدم العديد من المزايا بالمقارنة مع الطرق المتاحة سابقا تجزيء. هذا النظام قادر على تجزئة يصل إلى 1mg من البروتين الكلي لكل قناة ، أي ما مجموعه 8mg في خرطوشة. يتم فصل البروتينات سليمة على نطاق واسع شامل على أساس الوزن الجزيئي ، والإبقاء على الخصائص الفيزيائية الهامة لتحليلها. في المرحلة انحباس السوائل يوفر لاسترداد عالية بينما يلغي الحاجة لقطع الفرقة أو البقعة ، مما يجعل عملية التجزيء استنساخه للغاية 1.

Protocol

1. عينة بروتين التحضير

  1. في أنبوب 500 microfuge ميكرولتر ، والجمع بين ما يلي :
الكاشف حجم لإضافة :
* عينة بروتين (حتى 1 ملغ) ما يصل الى 112 ميكرولتر
الاحتياطي العينة (5X) المنصوص عليها في عدة خرطوشة 30 ميكرولتر
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O س ميكرولتر إلى مجموع حجم عينة من 150μL **
  1. تفسد العينات في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبرد لدرجة حرارة الغرفة.

* سيكون إجمالي من البروتين لفصل تعتمد على التعقيد في العينة. لعينات أكثر تعقيدا ، مثل جناسة الأنسجة ، وينصح 150-200 ميكروغرام لكل قناة.

** وإذا كان حجم العينة أقل من 112 ميكرولتر ، إضافة Ω 18 H 2 O لجعل الحجم النهائي إلى 150 ميكرولتر.

2. تحميل خرطوشة GELFREE

  1. إزالة GELFREE 8100 خرطوشة من احباط الحقيبة.
  2. إزالة وتجاهل السداده لوحة.
  3. إزالة العازلة التخزين من المقصورات خرطوشة باستخدام ماصة. إذا كان سيتم استخدام كافة الغرف 8 من خرطوشة ، يمكن مقلوب خرطوشة لاستنزاف العازلة التخزين من المقصورات.
  4. تعد خرطوشة لتحميل بإضافة GELFREE الاحتياطي لتشغيل كل غرفة خرطوشة على النحو التالي :
GELFREE غرفة خرطوشة حجم الاحتياطي GELFREE الجري لإضافة
الأنود العازلة الخزان 8 مل
الكاثود الخزان العازلة 6 مل
جمع الغرف 100 ميكرولتر كل
  1. إزالة وتجاهل أي العازلة من العينة حجرة التحميل.
  2. تحميل عينات من 150 ميكرولتر في غرف التحميل باستخدام pipettor 8 قنوات.
  3. مكان خرطوشة تحميلها في محطة تقطير GELFREE 8100. انخفاض صفائف الكهربائي وإغلاق الغطاء.

3. تشغيل خرطوشة

  1. باستخدام أداة ليالي شاشة تعمل باللمس ، اضغط على زر طريقة لعرض قائمة مبرمجة مسبقا الأساليب. كل من الأساليب مبرمجة مسبقا يتكون من مجموعة الفولتية ويتوقف الوقت التي ترمي إلى حل البروتينات داخل نطاق معين من الأوزان الجزيئية. سوف نتوقف GELFREE 8100 تلقائيا لجمع جزء في الفترات المحددة في الأسلوب.
  2. مرة واحدة وقد تم التعرف على الأسلوب المناسب ، اضغط على زر استرداد ، وأدخل عدد من الأسلوب مبرمجة مسبقا المطلوب باستخدام لوحة المفاتيح التي تظهر على الشاشة. اضغط موافق ، ثم اضغط على زر تطبيق. والأسلوب الذي تم تطبيقه تظهر في الجزء السفلي من الشاشة الرئيسية.
  3. لتحديد قنوات (عدد العينات) التي سيتم استخدامها في تشغيل ، اضغط على زر القناة على الشاشة الرئيسية. لتحديد كافة ثماني قنوات ، اضغط على اختيار جميع. ثم ، اضغط على القيام به للعودة الى الشاشة الرئيسية.
  4. ضمان أن يتم إغلاق الغطاء السلامة والتي على ضوء المؤشر الأخضر في أسفل الشاشة.
  5. لبدء فصل البروتين ، اضغط على بدء. محطة تقطير وقفة تلقائيا عندما يحين الوقت لجمع الكسور ملاحظة : على الرغم من أن النظام يعمل ، والدوائر هو مبين في المربع الموجود على الجانب الأيسر من الشاشة تصوير حالة كل قناة. دائرة خضراء يشير إلى أن قناة نشطة ، دائرة صفراء تشير إلى أن الصك قد توقفت ، ودائرة حمراء تشير إلى أن القناة قد فشلت. يتم عرض الفولتية المطبقة والتيارات على يمين الدوائر حالة القناة. يجب فقط عندما تتم إزالة أجزاء الدوائر تحولت حالة الصفراء وتنبيه يظهر النص على الشاشة وثيقة ق.
  6. لإزالة الكسور ، وفتح غطاء الجهاز واستخدام ماصة 8 قنوات لسحب 150 ميكرولتر من كل دائرة من الدوائر المجموعة.
  7. بمجرد أن تمت إزالة الكسور ، وغسل الغرفة جمع مرتين مع GELFREE الاحتياطي قيد التشغيل من خلال إضافة 100 ميكرولتر لكل قناة وpipetting صعودا وهبوطا مرتين.
  8. بعد الغسيل ، إضافة 100uL GELFREE من تشغيل المخزن المؤقت بالعودة الى غرف جمع وإغلاق الغطاء ، واضغط على الزر استئناف.
  9. سوف تستمر حتى 8100 GELFREE الفاصل في المرة القادمة. يتم عرض إجمالي الوقت المتبقي في التجربة على الجانب الأيمن من الشاشة. للتبديل بين الوقت المتبقي والوقت المنقضي والوقت للتوقف ، اضغط على زر أعلى مربع عرض الوقت.
  10. وقد شارك مرة واحدة كل من الكسورllected ، ويمكن استخدامها على الفور لإعداد المزيد من المتلقين ، مثل التركيز أو كهرساوي الكهربائي للهلام ، أو لتحليل السائل باستخدام الطيف اللوني أو immunoaffinity الشامل.

4. ممثل النتائج

تم تقسيم A ميكروغرام 200 من جناسة الكبد البقري إلى 12 أجزاء لكل منها ، باستخدام نظام التقطير GELFREE. تم تشغيل 6 ميكرولتر من كل جزء على هلام 1D القياسية SDS PAGE الملون والفضة. كانت عينة البروتين كما هو مبين في الشكل 1 ، مجزأة إلى 12 كسور مختلفة ، تغطي مجموعة من الوزن الجزيئي ل3.5kDa 150kDa. وتبين أيضا معيار الوزن الجزيئي (ColorBurst ، سيغما) في الممرات 1 و 14. الجل هو موضح هنا يبرز ارتفاع معدل استرداد يتحقق باستخدام GELFREE 8100 نظام لتجزئة البروتين. الجل هو موضح هنا يمثل 4 ٪ من البروتين تعافى من 200 ميكروغرام.

الشكل 1
الشكل 1. جناسة فصل البروتينات من الكبد البقري باستخدام نظام التقطير GELFREE. تم تحميل 6 ميكرولتر من كل جزء 150 ميكرولتر وتعمل على جل SDS PAGE 1D الملون والفضة. تم تحميلها أيضا الوزن الجزيئي (MW) القياسية كما هو محدد. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

Discussion

نظام التقطير GELFREE 8100 يوفر وسيلة سريعة وطريقة بسيطة وقابلة للتكرار لتقسيم عينات البروتين المعقدة الى الوزن الجزيئي منفصلة على أساس الكسور. هذا الأسلوب من رواية تجزئة يلغي الحاجة لقطع الفرقة أو البقعة ، مما يجعل من الممكن لعزل البروتينات على نطاق واسع شامل في 90 دقيقة. القدرة على تحميل كميات كبيرة نسبيا من العينة واسترداد كسور في المرحلة السائلة مفيدة بشكل خاص في عزلة وتحليل البروتينات منخفضة وفرة ، والتي عادة ما تكون أكثر صعوبة في الكشف عنها. ويمكن بعد ذلك الكسور الناتجة يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل LC - MS ، TOF MALDI ، وimmunoblotting.

Disclosures

ويعمل واضعو هذه المقالة عن طريق اكتشاف البروتين الذي ينتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter