Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

הסרטון מלווה מתאר את השימוש של מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה, אשר מחיצות דגימות חלבון מורכב על בסיס משקל מולקולרי ומשחזרת את השברים בשלב נוזלי. הסרטון מתאר כיצד הטכנולוגיה עובדת, וכיצד נעשה בו שימוש, ומספק נתונים כתוצאה, עם ניתוח ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide של homogenate מופרדים בכבד בקר.

Abstract

מערכת 8100 GELFREE ההיפוך חלוקה היא חלבון רומן חלוקה מערכת שנועדה למקסם התאוששות חלבון במהלך חלוקה משקל מולקולרי מבוסס. מערכת מורכבת של שימוש יחיד, 8 מחסניות מדגם קיבולת כלי GELFREE benchtop ההיפוך חלוקה. במהלך ההפרדה, מתח קבוע מוחל בין האנודה ומאגרי קטודה, וכל תערובת חלבון מונע electrophoretically מתוך חדר טעינה לתוך הג'ל תוכננו במיוחד טור ג'ל. חלבונים מרוכזים ללהקה חזק ג'ל הערמה, והופרדו מבוסס על mobilities electrophoretic שלהם בתוך ג'ל לפתרון. כמו חלבונים elute מהעמודה, הם לכודים והתרכז בשלב נוזלי בתא האיסוף, ללא ג'ל. המכשיר הוא עצר ואז במרווחי זמן מסוים, שברים נאספים בעזרת פיפטה. תהליך זה חוזר על עצמו עד שכל שברים הרצוי נאספו. אם פחות מ 8 דגימות מנוהלות על מחסנית, כל החדרים שאינם בשימוש ניתן להשתמש הפרדות הבאים.

טכנולוגיה חדשנית זו מאפשרת הפרדה מהירה ופשוטה של ​​עד 8 תערובות חלבונים מורכבות במקביל, מציע מספר יתרונות בהשוואה לשיטות חלוקה זמין קודם לכן. מערכת זו מסוגלת fractionating עד 1 מ"ג של חלבון הכולל לכל ערוץ, עבור סכום כולל של 8mg בכל מחסנית. חלבונים שלמים על פני טווח רחב מסה מופרדים על בסיס משקל מולקולרי, שמירה על המאפיינים החשובים של physiochemical אנליטי. מלכודת שלב נוזלי מספק עבור התאוששות גבוהה תוך ביטול הצורך הלהקה או חיתוך במקום, מה שהופך את תהליך חלוקה מאוד לשחזור 1.

Protocol

1. חלבון לדוגמא הכנה

  1. בתוך צינור 500 microfuge μl, לשלב את הפעולות הבאות:
מגיב כרך להוסיף:
* חלבון המדגם (עד 1 מ"ג) עד 112 μL
מאגר דוגמאות (5X) המסופק בערכה מחסנית 30 μL
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O x μL לסך של נפח דגימה של 150μL **
  1. לפגל דגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מצננים לטמפרטורת החדר.

* הכמות הכוללת של חלבון להיפרד יהיה תלוי במורכבות של המדגם. לקבלת דוגמאות מורכבות יותר, כגון homogenate רקמות, 150-200 מיקרוגרם לערוץ מומלץ.

** אם היקף המדגם הוא פחות מ 112 μL, להוסיף 18 Ω H 2 O להביא את נפח הסופי μL 150.

2. טוען מחסנית GELFREE

  1. הסר את מחסנית GELFREE 8100 משקיק את נייר הכסף.
  2. הסר להתעלמות אוטם צלחת.
  3. הסר את חוצץ אחסון מן התאים מחסנית באמצעות פיפטה. אם כל 8 חדרי מחסנית ישמשו, מחסנית יכול להיות הפוך כדי לרוקן את מאגר אחסון של התאים.
  4. הכן את מחסנית לטעינת ידי הוספת מאגר ריצה GELFREE לכל אחד מתאי מחסנית כדלקמן:
GELFREE דיו הקאמרית נפח הצפת GELFREE ריצה להוסיף
חיץ האנודה המאגר 8 מ"ל
קטודה מאגר חיץ 6 מ"ל
אוסף לתאי 100 μL כל
  1. הסר וזורקים כל חיץ מן החדר טעינת המדגם.
  2. טען את 150 דגימות μL לתאי טעינה באמצעות pipettor 8 ערוצים.
  3. הנח את מחסנית נטען לתוך תחנת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה. מנמיכים את מערכי אלקטרודות ולסגור את המכסה.

3. ריצה את מחסנית

  1. באמצעות התצוגה של מכשיר מסך מגע, לחצו על לחצן שיטה להציג את רשימת מתוכנתים מראש שיטות. כל אחד מתוכנתים מראש שיטות מורכב מתח להגדיר זמן מבוססי הפסקות שנועדו לפתור חלבונים בתוך טווח מסוים של משקל מולקולרי. 8100 GELFREE להשהות באופן אוטומטי לאיסוף חלק במרווחים המפורטים השיטה.
  2. לאחר בשיטה המתאימה זוהה, לחצו על לחצן לאחזר, והזן את המספר של השיטה מתוכנתים מראש הרצוי באמצעות לוח המקשים על המסך. לחץ על OK, ולאחר מכן לחצו על כפתור להחיל. השיטה יושמה יופיע בתחתית המסך הראשי.
  3. כדי לבחור את הערוצים (מספר דוגמאות) אשר ישמשו בטווח, לחצו על לחצן הערוץ על המסך הראשי. כדי לבחור את כל שמונה ערוצים, לחץ על בחר הכל. לאחר מכן, הקש לעשות כדי לחזור למסך הראשי.
  4. ודא מכסה בטיחות סגור כי נורית החיווי הירוקה בחלק התחתון של המסך.
  5. כדי להתחיל את ההפרדה לחלבון, לחצו להתחיל. תחנת ההיפוך חלוקה אוטומטית הפסקה כאשר הגיע הזמן לאסוף את השברים. הערה: כאשר המערכת פועלת, חוגי מוצגים בתיבה בצד שמאל של המסך לתאר את המצב של כל ערוץ. עיגול ירוק עולה כי הערוץ הוא פעיל, עיגול צהוב עולה כי המכשיר כבר עצר, עיגול אדום עולה כי הערוץ נכשל. מתח להחיל וזרמים מוצגים בצד ימין של החוגים מצב הערוץ. שברים צריך רק להיות מוסר כאשר החוגים מעמד הפכו צהוב התראת הטקסט מופיע על המסך של המכשיר.
  6. כדי להסיר שברים, לפתוח את המכסה של המכשיר ולהשתמש ערוץ 8-פיפטה לסגת 150 μL מכל אחד לתאי האיסוף.
  7. לאחר שברים הוסרו, לשטוף את קאמרית אוסף כפול עם הצפת ריצה GELFREE ידי הוספת 100 μl לערוץ ו pipetting למעלה ולמטה פעמיים.
  8. לאחר כביסה, להוסיף 100uL של GELFREE ריצה הצפת בחזרה לתאי איסוף, לסגור את המכסה, ולחץ על כפתור לחדש.
  9. GELFREE 8100 תוצג עד ההפסקה בפעם הבאה. הזמן הכולל שנותרו הניסוי מוצג בצד ימין של המסך. כדי לעבור בין הזמן שנותר, הזמן שחלף, זמן הפסקה, לחצו על לחצן מעל תיבת הצגת זמן.
  10. לאחר שכל החלקים כבר שותףllected, הם יכולים מיד לשמש להכנת במורד נוספים, כגון התמקדות isoelectric או ג'ל אלקטרופורזה, או לניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה או immunoaffinity.

4. נציג תוצאות

200 מיקרוגרם של homogenate הכבד שור חולקה 12 שברים בכל, באמצעות מערכת ההיפוך חלוקה GELFREE. 6 μL של כל חלק היה להריץ על ג'ל SDS סטנדרטית לעמוד 1D ומוכתמת כסף. כפי שניתן לראות בתרשים 1, המדגם היה חלבון מופרדים לתוך 12 שברים ברורים, פורש את טווח משקל מולקולרי של 3.5kDa כדי 150kDa. תקן משקל מולקולרי (ColorBurst, Sigma) מוצגים גם מסלולים 1 ו - 14. ג'ל המוצג כאן מדגיש את קצב התאוששות גבוהה מושגת באמצעות מערכת GELFREE 8100 עבור חלוקה חלבון. ג'ל המוצג כאן מייצג 4% של החלבון התאושש 200 מיקרוגרם.

איור 1
באיור 1. חלבונים מהכבד שור homogenate מופרדים באמצעות מערכת ההיפוך חלוקה GELFREE. 6 μL של כל חלק 150 μL היה טעון לרוץ על ג'ל SDS 1D דף מוכתם כסף. תקן מולקולרית (MW) משקל היה טעון גם כמצוין. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

Discussion

מערכת 8100 GELFREE ההיפוך חלוקה מספק שיטה מהירה, פשוטה לשעתקו לחלוקת דגימות חלבון מורכב לתוך משקל מולקולרי מבוססי בדידה שברים. זו שיטה חדשה של חלוקה מבטלת את הצורך של הלהקה או חיתוך במקום, מה שהופך אותו ניתן לבודד חלבונים על פני טווח רחב המונית ב 90 דקות. היכולת להעמיס כמויות גדולות יחסית של המדגם להתאושש שברים בשלב נוזל שימושי במיוחד בבידוד וניתוח נמוכה שפע חלבונים, שהם בדרך כלל יותר קשה לזהות. שברים כתוצאה מכך לאחר מכן ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים, כגון LC-MS, MALDI-TOF ו immunoblotting.

Disclosures

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי גילוי חלבון המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter