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Biology

आण्विक Fractionation वजन के आधार के लिए तरल चरण रिकवरी के साथ GELFREE 8100 Fractionation प्रणाली का उपयोग

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

साथ वीडियो GELFREE 8100 Fractionation प्रणाली का उपयोग, जो आणविक भार के आधार पर विभाजन जटिल प्रोटीन के नमूने का वर्णन करता है और तरल चरण में भिन्न ठीक है. वीडियो वर्णन कैसे प्रौद्योगिकी काम करता है, यह कैसे प्रयोग किया जाता है, और परिणामी डेटा fractionated गोजातीय जिगर homogenate polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण के साथ प्रदान करता है,.

Abstract

GELFREE 8100 Fractionation सिस्टम एक उपन्यास प्रोटीन fractionation आणविक वजन आधारित fractionation के दौरान प्रोटीन वसूली को अधिकतम करने के लिए डिजाइन प्रणाली है. प्रणाली एकल उपयोग, 8 नमूना क्षमता कारतूस और एक benchtop GELFREE Fractionation साधन शामिल है. जुदाई के दौरान, एक स्थिर वोल्टेज anode और कैथोड जलाशयों के बीच लागू किया जाता है, और प्रत्येक प्रोटीन मिश्रण electrophoretically एक विशेष रूप से डिजाइन जेल स्तंभ जेल में एक लोडिंग कक्ष से प्रेरित है. प्रोटीन एक stacking जेल में एक तंग बैंड में केंद्रित कर रहे हैं, और उनके एक हल जेल में संबंधित electrophoretic mobilities पर आधारित अलग. के रूप में प्रोटीन स्तंभ से elute, वे फंस रहे हैं और तरल चरण में केंद्रित संग्रह के चैम्बर में, जेल से मुक्त. साधन तो विशिष्ट समय अंतराल पर रुका हुआ है, और भिन्न एक विंदुक का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं. इस प्रक्रिया को दोहराया है जब तक सभी इच्छित भिन्न एकत्र किया गया है. यदि एक कारतूस से कम 8 नमूने पर चलाए जा रहे हैं, किसी भी अप्रयुक्त कक्षों बाद separations में इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस उपन्यास प्रौद्योगिकी 8 जटिल प्रोटीन एक साथ मिश्रण अप करने के लिए जल्दी और सरल जुदाई की सुविधा है, और कई लाभ प्रदान करता है जब पहले से उपलब्ध fractionation तरीकों की तुलना में. कारतूस प्रति 8mg की कुल के लिए इस प्रणाली 1mg प्रति चैनल कुल प्रोटीन की fractionating में सक्षम है. एक व्यापक जन सीमा पर बरकरार प्रोटीन आणविक वजन के आधार पर अलग हो रहे हैं, analyte के महत्वपूर्ण physiochemical गुणों को बनाए रखना. तरल चरण फंसाने उच्च वसूली के लिए प्रदान करता है, जबकि बैंड या हाजिर काटने के लिए नष्ट करने की जरूरत है, fractionation प्रक्रिया अत्यधिक एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने.

Protocol

1. नमूना प्रोटीन तैयार

  1. एक 500 μl microfuge ट्यूब में, निम्न गठबंधन:
अभिकर्मक वॉल्यूम को जोड़ने:
* प्रोटीन नमूना (1 मिलीग्राम) 112 μL
नमूना बफर (5X) कारतूस किट में प्रदान की 30 μL
डीटीटी 1M 8μL
18 Ω एच 2 हे 150μL नमूना मात्रा की कुल करने के लिए μL x **
  1. 95 में नमूने denature डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए. कमरे के तापमान को शांत.

* अलग किया जा प्रोटीन की कुल राशि नमूना की जटिलता पर निर्भर करेगा. ऐसे ऊतक homogenate के रूप में और अधिक जटिल नमूने, के लिए, चैनल प्रति 150-200 μg की सिफारिश की है.

** यदि नमूना मात्रा 112 से कम μL है, 18 Ω एच 2 हे जोड़ने के लिए 150 μL अंतिम मात्रा लाने के.

2. GELFREE कारतूस लोड हो रहा है

  1. पन्नी पाउच से GELFREE 8100 कारतूस निकालें.
  2. निकालें और प्लेट मुहर त्यागें.
  3. कारतूस एक विंदुक का उपयोग डिब्बों से भंडारण बफर निकालें. यदि कारतूस के सभी आठ कक्षों उपयोग किया जाएगा, कारतूस डिब्बों से भंडारण बफर नाली औंधा किया जा सकता है है.
  4. कारतूस कक्षों में से प्रत्येक GELFREE रनिंग बफर जोड़ने के रूप में इस प्रकार से कारतूस लोड करने के लिए तैयार:
GELFREE कारतूस कक्ष GELFREE रनिंग बफर जोड़ने की मात्रा
Anode बफर जलाशय 8 एमएल
कैथोड बफर जलाशय 6 एमएल
संग्रह कक्षों 100 μL प्रत्येक
  1. नमूना लोड हो रहा चैम्बर से कोई बफर निकालें और त्यागने.
  2. लोड हो रहा है एक 8 - चैनल pipettor का उपयोग कर कक्षों में 150 μL नमूने लोड.
  3. GELFREE 8100 Fractionation स्टेशन में भरी हुई कारतूस प्लेस. इलेक्ट्रोड arrays के निचले और ढक्कन बंद करें.

3. कारतूस रनिंग

  1. साधन स्पर्श स्क्रीन प्रदर्शन का प्रयोग, विधि बटन दबाएँ पूर्व क्रमादेशित तरीकों की सूची देखने के लिए. पूर्व क्रमादेशित तरीकों के प्रत्येक सेट voltages और समय आधारित pauses के आणविक वजन की एक विशिष्ट श्रेणी के भीतर प्रोटीन को हल करने के लिए डिज़ाइन के होते हैं. GELFREE 8100 विधि में निर्दिष्ट अंतराल पर स्वचालित रूप से अंश संग्रह के लिए विरामित.
  2. एक बार उपयुक्त विधि की पहचान की गई है, पुनः प्राप्त बटन दबाएँ, और वांछित पूर्व क्रमादेशित ऑन - स्क्रीन कीपैड विधि का उपयोग कर की संख्या दर्ज करें. ठीक प्रेस, तो लागू बटन दबाएँ. तरीका है कि लागू किया गया है मुख्य स्क्रीन के तल पर दिखाई देगा.
  3. चैनलों कि रन में उपयोग किया जाएगा (नमूनों की संख्या) का चयन करने के लिए मुख्य स्क्रीन पर चैनल बटन दबाएँ. सभी आठ चैनलों का चयन करने के लिए, सभी का चयन करें दबाएँ. फिर, मुख्य स्क्रीन पर लौटने के लिए किया दबाएँ.
  4. सुनिश्चित करें कि सुरक्षा ढक्कन बंद कर दिया है और स्क्रीन के नीचे स्थित सूचक प्रकाश हरी है.
  5. प्रोटीन जुदाई शुरू शुरू दबाएँ. Fractionation स्टेशन स्वतः थामने जब ​​यह नोट भिन्न इकट्ठा करने के लिए समय है जबकि सिस्टम चल रहा है, स्क्रीन के बाईं ओर बॉक्स में दिखाया गया है हलकों प्रत्येक चैनल की स्थिति को दर्शाती है. एक ग्रीन सर्कल इंगित करता है कि चैनल सक्रिय है, एक पीला वृत्त इंगित करता है कि साधन पॉज़ किए गए है, और एक लाल वृत्त इंगित करता है कि चैनल में नाकाम रही है. लागू voltages और धाराओं चैनल स्थिति हलकों के अधिकार के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं . Fractions केवल जब स्थिति हलकों पीला कर दिया है और एक पाठ चेतावनी एस साधन स्क्रीन पर प्रकट होता है हटा दिया जाना चाहिए.
  6. भिन्न हटायें साधन के ढक्कन खुला है और एक 8 चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए संग्रह कक्षों में से प्रत्येक से 150 μL वापस लेने.
  7. एक बार भिन्न हटा दिया गया है, संग्रह चैम्बर चैनल प्रति 100 μl जोड़ने और ऊपर और नीचे pipetting दो बार दो बार GELFREE रनिंग बफर के साथ धो.
  8. धोने के बाद, GELFREE के 100uL बफर संग्रह कक्षों में वापस रनिंग जोड़ने के लिए, ढक्कन बंद करें, और फिर से शुरू बटन दबाएँ.
  9. 8100 GELFREE अगले समय अंतराल तक चलेगा. प्रयोग में कुल शेष समय स्क्रीन के दाहिने हाथ की ओर दिखाया गया है. शेष समय के बीच टॉगल करने के लिए, समय बीत और को थामने के लिए समय, समय प्रदर्शित बॉक्स के ऊपर के बटन दबाएँ.
  10. एक बार सभी भागों का सह गया हैllected, वे तुरंत isoelectric ध्यान केंद्रित या जेल वैद्युतकणसंचलन के रूप में आगे डाउनस्ट्रीम तैयारी, के लिए या तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री या immunoaffinity का उपयोग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम

गोजातीय जिगर homogenate के 200 μg 12 प्रत्येक भागों में विभाजित किया गया था, GELFREE Fractionation प्रणाली का उपयोग. प्रत्येक अंश के 6 μL एक मानक 1D एसडीएस PAGE जेल और चांदी दाग ​​पर चलाया गया था. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, प्रोटीन नमूना 12 अलग भागों में fractionated था, 3.5kDa से 150kDa के लिए आणविक वजन सीमा फैले. एक आण्विक वजन (ColorBurst, सिग्मा) मानक भी गलियों 1 और 14 में दिखाए जाते हैं. यहाँ दिखाया जेल उच्च वसूली दर हासिल प्रोटीन fractionation के लिए GELFREE 8100 प्रणाली का उपयोग पर प्रकाश डाला गया. जेल यहाँ दिखाया μg 200 से बरामद प्रोटीन के 4% का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. गोजातीय जिगर से प्रोटीन GELFREE Fractionation प्रणाली का उपयोग कर अलग homogenate प्रत्येक μL 150 अंश के 6 μL लोड किया गया था और एक 1D एसडीएस PAGE जेल और चांदी दाग पर चलने. एक आण्विक वजन (मेगावाट) मानक के रूप में भी संकेत भरी हुई थी. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.

Discussion

GELFREE 8100 Fractionation सिस्टम असतत के आणविक वजन आधारित भिन्न में जटिल प्रोटीन के नमूने विभाजन के लिए एक त्वरित, सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका उपलब्ध कराता है. Fractionation के इस उपन्यास विधि बैंड या हाजिर काटने के लिए की आवश्यकता eliminates, यह एक व्यापक जन सीमा पर संभव 90 मिनट में प्रोटीन को अलग करने के लिए बना. नमूना की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में लोड करने के लिए और तरल चरण में भिन्न पुनर्प्राप्त करने की क्षमता विशेष रूप से अलगाव और कम प्रोटीन बहुतायत है, जो आमतौर पर अधिक का पता लगाने के लिए मुश्किल के विश्लेषण में उपयोगी है. परिणामस्वरूप भिन्न तो LC-एमएस, MALDI-TOF, और immunoblotting जैसे अनुप्रयोगों की एक विस्तृत सरणी में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Disclosures

इस लेख के लेखक है कि अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों का उत्पादन प्रोटीन डिस्कवरी द्वारा नियोजित कर रहे हैं.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
आण्विक Fractionation वजन के आधार के लिए तरल चरण रिकवरी के साथ GELFREE 8100 Fractionation प्रणाली का उपयोग
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Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

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