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Biology

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

付属のビデオでは、分子量に基づいてGELFREE 8100分画システムの使用、パーティションの複雑なタンパク質サンプルを説明し、液相での分画を回収する。ビデオは、それが使用されているか、技術がどのように動作するかについて説明し、分画されたウシ肝臓のホモジネートのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析で、結果のデータを提供します。

Abstract

GELFREE 8100分別システムは、分子量に基づく分画中のタンパク質の回収を最大化するよう設計された新規タンパク質分画システムです。システムは、シングルユース、8サンプルの容量のカートリッジとベンチトップGELFREE分画音源で構成されています。分離時には、一定の電圧が陽極と陰極リザーバとの間に印加されると、各タ​​ンパク質の混合物を電気泳動的に特別に設計されたゲルカラムゲルにロードするチャンバーから駆動されます。タンパク質がスタッキングゲルでタイトなバンドに集中し、そして分離ゲルのそれぞれの電気泳動移動度に基づいて分離されている。カラムから溶出するタンパク質として、彼らが閉じ込められたと収集チャンバ内の液相に集中し、ゲルの自由 。楽器は、特定の時間間隔で一時停止され、そして画分をピペットを用いて収集されます。すべての所望の画分が回収されるまで、このプロセスが繰り返されます。未満の8サンプルがカートリッジ上で実行されている場合、未使用の任意のチャンバーはその後の分離に使用することができます。

この新技術は、同時に最大8複雑なタンパク質混合物の迅速かつ簡単な分離を容易にし、以前に利用可能な分画法と比較した場合、いくつかの利点を提供しています。このシステムは、カートリッジあたり8mgの合計で、チャネルあたりの総タンパク質1mgの、最大の分画が可能です。広い質量範囲にわたって無傷のタンパク質は、分析対象物の重要な物理化学的性質を保持し、分子量に基づいて分離されています。バンドまたはスポットカットの必要性を排除しながら、液相の巻き込みは、1分画のプロセスは、再現性の高いこと、高い回復のために用意されています。

Protocol

1。サンプルのタンパク質の調製

  1. 500μlの微量遠心チューブに、次のように組み合わせる。
試薬追加するボリューム:
*タンパク質のサンプル(最大1mg)を最大112μLまで
カートリッジキットに付属のサンプルバッファー(5X) 30μL
DTT 1M 8μL
18ΩH 2 O 150μLのサンプル量の合計**からxμL
  1. ℃で5分間、95℃の試料の変性。室温まで冷却。

*分離されるタンパク質の総量は、サンプルの複雑さに依存します。このような組織ホモジネートなどのより複雑なサンプルについては、チャンネルあたり150から200μgのをお勧めします

**サンプル量がより小さい112μLの場合は、150μLに最終的なボリュームをもたらすために、18Ω、H 2 Oを加える。

2。 GELFREEカートリッジのロード

  1. 箔の袋からGELFREE 8100カートリッジを取り外します。
  2. プレートシーラーを取り外して廃棄。
  3. ピペットを使用してカートリッジの各コンパートメントからストレージのバッファを削除します。カートリッジの全8室が使用される場合、カートリッジは区画からストレージのバッファをドレインに反転させることができます。
  4. 次のようにカートリッジ室の各々にGELFREEランニングバッファーを追加してロードするためのカートリッジを準備します。
GELFREEカートリッジ商工会議所追加するGELFREEランニングバッファーの量
陽極バッファータンク 8 mLの
陰極バッファータンク 6 mLの
コレクション室 100μL各
  1. サンプルのローディング室から任意のバッファを削除し、捨てる。
  2. 8チャンネルピペッターを使用してロードのチャンバーに150μLのサンプルをロードします。
  3. GELFREE 8100分別ステーションにロードされたカートリッジを置きます。電極アレイを下げて、蓋を閉じます。

3。カートリッジの実行

  1. 楽器のタッチスクリーンディスプレイを使用して、事前にプログラムされたメソッドのリストを表示する方法のボタンを押してください。事前にプログラムの各メソッドは、分子量の特定の範囲内のタンパク質を解決するために設計された一連の電圧と時間ベースのポーズで構成されています。 GELFREE 8100はメソッドで指定された間隔でフラクションコレクションのために自動的に一時停止します。
  2. 一旦、適切なメソッドが識別されて、 取得ボタンを押すと、画面上のキーパッドを用いて所望のプリプログラム方法の番号を入力します。 [OK]を押して、[ 適用]ボタンを押してください。適用されたメソッドは、メイン画面の下部に表示されます。
  3. 実行時 ​​に使用されるチャネル(サンプル数)を選択するには、メイン画面上のチャンネルボタンを押してください。すべての8つのチャネルを選択するには、 すべてを選択キーを押します。次に、メイン画面に戻りますDoneを押します。
  4. 安全蓋が閉じていることを確認し、インジケータライトが画面の下部にある緑色であること。
  5. タンパク質の分離を開始するには、 スタートを押してください 。それは画分を集めた時期になると分別ステーションは自動的に一時停止される注:システムが動作している間、画面の左側にあるボックスに示されている円は、各チャネルの状態を表しています。緑色の円は、チャネルがアクティブであることを示し、黄色の円は、機器が一時停止していることを示し、赤い円は、チャネルが失敗したことを示します。印加される電圧と電流はチャネルステータス円の右側に表示されます。ステータス円が黄色になっているとテキストのアラートが機器の画面上に表示されたときの画分をのみ削除する必要があります。
  6. 分画を削除するには、楽器の蓋を開き、コレクションのチャンバーのそれぞれから150μLを撤回する8チャンネルピペットを使用してください。
  7. 分画が削除されたら、チャンネルあたり100μLを追加し、二回、上下にピペッティングすることによりGELFREEランニング緩衝液で2回収集チャンバーを洗浄する。
  8. 洗浄後、コレクション室に戻ってバッファを実行GELFREEの100uL追加、蓋を閉め、 再開ボタンを押してください。
  9. GELFREE 8100は次の時間間隔になるまで実行されます。実験に残っている合計時間が画面の右側に表示されます。 残り時間を切り替えるには、時間が経過、一時停止の時間、時間を表示するボックスの上のボタンを押してください。
  10. 一度画分のすべてを同じ場所にされているllectedは、彼らはすぐにこのような等電点電気泳動やゲル電気泳動などのさらなる下流の準備、、または液体クロマトグラフィー質量分析法または免疫親和性を用いて分析するために使用することができます。

4。代表的な結果

ウシ肝臓ホモジネートの200μgのはGELFREE分別システムを使用して、12分画ごとに分割されました。各画分の6μLを標準1D SDS PAGEゲルと銀染色上で実行された。図1に示すように、タンパク質サンプルは3.5kDaから150kDaに分子量の範囲にまたがる、12種類の画分に分画した。分子量の標準は、(カラーバースト、シグマ)またレーン1及び14に示されています。ここに示されているゲルは、タンパク質の分画にGELFREE 8100システムを使用して達成高回収率を強調。ここに示されているゲルは、200μgのから回収したタンパク質の4%を表します。

図1
図1。 GELFREE分画システムを使用して分離されたウシ肝臓のホモジネートからのタンパク質が各 150μL分画の6μLは、1D SDS PAGEゲルと銀染色でロードされ、実行されました。示されるように分子量(MW)標準にもロードされました。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

Discussion

GELFREE 8100分別システムは、離散的な分子量ベースのフラクションに複雑なタンパク質サンプルを分割するための迅速、簡単かつ再現性のある方法を提供する。分別のこの新しい方法により、90分で広い質量範囲にわたってタンパク質を分離すること、バンドやスポットをカットする必要がなくなります。サンプルの比較的大量をロードし、液相での分画を回収する能力は、通常、検出が難しい低濃度タンパク質の単離と解析に特に有用です。得られた画分は、その後、LC - MS、MALDI - TOF、およびイムノブロッティングなどの幅広い用途で使用できます。

Disclosures

この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産するタンパク質の探索によって採用されています。

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用
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Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

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