Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

함께 비디오 GELFREE 8100 분획화 시스템의 사용, 분자량을 기준으로 파티션 복잡한 단백질 샘플을 설명하고 액상에있는 분수를 복구합니다. 비디오 기술이 사용 방법, 작동 및 fractionated 소 간 homogenate의 polyacrylamide 젤 전기 영동 분석, 결과 데이터를 제공하는 방법에 대해 설명합니다.

Abstract

GELFREE 8100 분획화 시스템은 분자량을 기반으로 분류하는 동안 단백질 복구를 극대화하기 위해 설계된 새로운 단백질 분획화 시스템입니다. 시스템은 단일 사용, 8 샘플 용량 카트리지와 benchtop GELFREE 분별 (분리) 악기로 구성되어 있습니다. 분리하는 동안 일정한 전압은 양극과 음극의 저수지 사이에 적용되며, 각각의 단백질 혼합물은 electrophoretically 로딩 챔버에서 특별히 고안된 젤 열 젤로 구동됩니다. 단백질은 스태킹 젤에 꽉 밴드에 집중하고, 해결 젤에 해당 전기 mobilities에 따라 구분됩니다. 단백질은 칼럼에서 elute으로, 그들은 수집 챔버에서 젤 무료 갇혀 액상에 집중되어있다. 악기 그런 다음 특정 시간 간격을 일시 중지하고, 분수는 피펫을 사용하여 수집하고 있습니다. 모든 원하는 분수가 수집 때까지이 과정이 반복됩니다. 이하 8 샘플 카트리지에서 실행하는 경우, 사용하지 않은 챔버 스는 후속 분리에 사용할 수 있습니다.

이 소설의 기술은 동시에 8 복잡한 단백질 혼합물까지 빠르고 간단한 분리를 용이하게하고, 이전에 사용 가능한 분류 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다. 이 시스템은 카트리지 당 8mg 총, 채널 당 총 단백질 1mg까지 fractionating이 가능합니다. 넓은 질량 범위에서 그대로 단백질은 analyte 중요한 physiochemical 속성을 유지, 분자량을 바탕으로 구분됩니다. 1 분획화 프로세스가 높은 재현성 만들기, 밴드 또는 현장 절단에 대한 필요성을 제거하면서 액상의 함정 수사가 높은 복구를 위해 제공합니다.

Protocol

1. 샘플 단백질 준비

  1. 500 μl microfuge 관에서 다음을 결합 :
시약 : 추가 볼륨
* 단백질 샘플 (최대 1 MG) 최대 112 μL에
카트리지 키트에 제공된 샘플 버퍼 (5 ​​배) 30 μL
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O X 150μL의 샘플 볼륨의 총 μL이 **
  1. ° C 5 분 95에서 샘플을 변성. 실내 온도 쿨.

* 분리되는 단백질의 총 금액은 샘플의 복잡성에 따라 달라집니다. 이러한 조직의 homogenate 같은 좀 더 복잡한 샘플, 들어, 채널 당 150-200 μg을 권장합니다.

샘플 볼륨 미만 112 μL입니다 ** 경우, 150 μL에 최종 볼륨을 가지고 18 Ω H 2 O를 추가할 수 있습니다.

2. GELFREE 카트리지를 로딩

  1. 호일 주머니에서 GELFREE 8100 카트리지를 제거합니다.
  2. 제거하고 판 실러를 폐기하십시오.
  3. 피펫을 사용하여 카트리지 구획에서 저장 버퍼를 제거합니다. 카트리지의 모든 8 실이 사용되는 경우, 카트리지는 구획에서 저장 버퍼를 유출하는 반전 수 있습니다.
  4. 다음과 같이 카트리지 실 각 GELFREE 실행 버퍼를 추가하여 로딩을 위해 카트리지를 준비 :
GELFREE 카트리지 챔버 추가 GELFREE 실행 버퍼의 볼륨
양극 버퍼 저수지 8 ML
음극 버퍼 저수지 6 ML
콜렉션 챔버스 100 μL 각
  1. 샘플 로딩 챔버로부터 버퍼를 제거하고 폐기.
  2. 8 채널 pipettor를 사용하여 로딩 챔버에 150 μL 샘플을로드합니다.
  3. GELFREE 8100 분획화 역에 로드된 카트리지를 놓습니다. 전극 배열을 낮추고 뚜껑을 닫습니다.

3. 카트리지를 실행

  1. 악기의 터치 스크린 디스플레이를 사용하여 미리 프로그램된 방법의 목록을 보려면 방법 버튼을 누르십시오. 미리 프로그램된 방법 각각의 분자 무게의 특정 범위 내에서 단백질을 해결하기위한 설정 전압 및 시간 기반 일시 중지로 구성되어 있습니다. GELFREE 8100는 방법에 지정된 간격으로 분수 수집에 대해 자동으로 일시 정지됩니다.
  2. 적절한 방법이 발견되면 검색 버튼을 누르면, 화면의 키패드를 사용하여 원하는 미리 프로그램된 방식의 번호를 입력합니다. 확인을 누르면 다음 적용 버튼을 누릅니다. 적용되고있는 방법은 메인 화면의 하단에 나타납니다.
  3. 실행에 사용됩니다 채널 (샘플 번호)를 선택하려면 주 화면에서 채널 버튼을 누르십시오. 몽땅 채널을 선택하려면 모두 선택을 누릅니다. 그런 다음, 기본 화면으로 돌아갑니다 완료 누르십시오.
  4. 안전 덮개가 닫혀 있는지 확인하고 표시등이 화면 하단에 녹색입니다.
  5. 단백질 분리를 시작하려면 시작을 누르십시오. . 그것이 분수 참고를 수집하는 시간이되면 분획화 스테이션 일시 자동 : 시스템이 실행되는 동안, 화면의 왼쪽에있는 상자에 표시된 동그라미는 각 채널의 상태를 묘사. 녹색 동그라미는 채널이 활성 상태임을 나타냅니다, 노란색 원은 악기 일시 중지했음을 나타냅니다, 그리고 빨간색 동그라미 채널이 실패했음을 나타냅니다. 적용 전압 및 전류는 채널 상태 동아리의 오른쪽에 표시됩니다. 상태 원에 노란색 설정되어 있고 텍스트 경고가 악기의 화면에 나타날 때 분수는 제거되어야합니다.
  6. 분수를 제거하려면, 악기의 뚜껑을 열고 수집 실의 각 150 μL를 철회하는 8 채널 피펫을 사용합니다.
  7. 분수가 제거되고 나면, 채널 당 100 μl를 추가하고 두 번하고 위아래로 pipetting하여 GELFREE 실행 버퍼와 함께 두 번 수집 챔버를 세척.
  8. 세척 후, 수집 실에 다시 버퍼를 실행 GELFREE의 100uL를 추가 뚜껑을 닫은 이력서 버튼을 누르십시오.
  9. GELFREE 8100은 다음 시간 간격까지 실행됩니다. 실험에 남아있는 총 시간은 화면의 오른쪽에 표시됩니다. 남은 시간 사이를 전환하려면 시간이 경과하고, 일시 정지 시간, 시간을 표시 상자 위에있는 버튼을 누르십시오.
  10. 일단 분수의 모든 공동되었습니다llected는, 그들은 즉시 isoelectric 초점이나 겔 전기 영동으로 더 하류 준비, 또는 액체 크로마 토그래피 질량 분석계 또는 면역 친 화성을 사용하여 분석을 위해 사용될 수 있습니다.

4. 대표 결과

보빈 간 homogenate의 200 μg가 GELFREE 분류 시스템을 사용하여, 12 분수 각으로 분할되었다. 각 분획 6 μL는 표준 1D SDS 페이지 젤과 실버 스테인드에서 실행되었습니다. 그림 1에 나타난 단백질 샘플 3.5kDa에서 150kDa으로 분자량 범위를 스팬, 12 독특한 분수로 fractionated되었습니다. 분자량 표준은 (ColorBurst, 시그마)도 차선 하나 14에 표시됩니다. 여기에 표시된 겔은 단백질 분류에 대한 GELFREE 8100 시스템을 사용하여 달성 높은 복구 속도를 강조 표시합니다. 여기에 표시된 젤 200 μg에서 발견한 단백질의 4 %를 나타냅니다.

그림 1
그림 1. 보빈 간장에서 단백질은 GELFREE 분류 시스템을 사용하여 분리 homogenate. 각 150 μL 분수 6 μL가로드 및 1D SDS 페이지 젤과 실버 스테인드에서 실행되었습니다. 표시된으로 ​​분자량 (MW) 표준도로드되었다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

Discussion

GELFREE 8100 분획화 시스템은 이산 분자량 기반의 분수로 복잡한 단백질 시료를 파티션을위한 빠르고, 간단하고 재현성 방법을 제공합니다. 분류의 방법이 소설은 가능한 90 분 이내에 광범위한 질량 범위 단백질을 분리하고, 밴드 또는 현장 절단에 대한 필요가 없습니다. 샘플 비교적 대량로드하고 액상의 분수를 복구할 수있는 능력은 일반적으로 검출에 더 어렵습니다 낮은 풍부한 단백질의 분리 및 분석에 특히 유용합니다. 그 결과 분수는 다음과 같은 LC - MS, 든 - TOF 및 immunoblotting 같은 어플 리케이션의 다양한 배열에서 사용할 수 있습니다.

Disclosures

이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산하는 단백질 발견으로 고용됩니다.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter