Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

Den medföljande videon beskriver användningen av GELFREE 8100 Fraktionering System, som partitioner komplexa protein prover på grundval av molekylvikt och återvinner fraktioner i flytande fas. Videon beskriver hur tekniken fungerar, hur den används, och ger resulterande data, med polyakrylamidgelelektrofores analys av fraktionerade nötkreatur lever homogenatet.

Abstract

Den GELFREE 8100 Fraktionering System är ett nytt protein fraktionering system som utformats för att maximera protein återhämtning under molekylvikt baserade fraktionering. Systemet består av engångsprodukter, 8-prov patroner kapacitet och en bänk GELFREE Fraktionering Instrument. Under separation, är en ständig spänning mellan anod och katod reservoarer och varje protein blandningen elektrofores drivs från en lastning kammare i en specialdesignad gel kolumnen gel. Proteiner är koncentrerade till ett tight band i en stapling gel, och separeras baserat på deras respektive elektrofores mobiliteter i en lösning av gel. Som proteiner rinna genom kolonnen, de är fångade och koncentrerad i flytande fas i uppsamlingsbehållaren, fri från gelen. Instrumentet är sedan pausas med bestämda tidsintervall, och fraktioner samlas in med hjälp av en pipett. Denna process upprepas tills alla önskade fraktioner har samlats in. Om färre än 8 prover körs på en kassett, kan oanvända kammare användas i senare separationer.

Denna nya teknologi möjliggör snabb och enkel separation av upp till 8 komplexa protein blandningar samtidigt, och erbjuder flera fördelar jämfört med tidigare tillgängliga fraktionering metoder. Detta system kan fraktionering upp till 1 mg av det totala protein per kanal, för totalt 8 mg per patron. Intakta proteiner över ett brett viktområde separeras på basis av molekylvikt, behålla viktiga fysiokemiska egenskaper hos analyten. Vätskefasen entrapment ger hög återhämtning samtidigt som eliminerar behovet av band eller plats skärning, vilket gör fraktioneringsprocess mycket reproducerbara 1.

Protocol

1. Exempel Protein Förberedelse

  1. I en 500 l mikrofugrör, kombinera följande:
Reagens Volym att lägga till:
* Protein prov (upp till 1 mg) Upp till 112 mikroliter
Exempel Buffer (5X) som föreskrivs i patron kit 30 mikroliter
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O x mikroliter till totalt provvolym på 150μL **
  1. Denaturera proverna vid 95 ° C i 5 minuter. Svalna till rumstemperatur.

* Den totala mängden protein separeras beror på komplexiteten i provet. För mer komplexa prover, såsom vävnad homogenat, är 150-200 mikrogram per kanal rekommenderas.

** Om provvolymen är mindre än 112 mikroliter, lägg till 18 Ω H 2 O för att få den slutliga volymen till 150 mikroliter.

2. Fylla på GELFREE Cartridge

  1. Ta bort GELFREE 8100 patronen ur foliepåsen.
  2. Ta bort och kasta plattförslutning.
  3. Ta bort lagring bufferten från patronen fack med hjälp av en pipett. Om alla åtta kamrar av patronen kommer att användas, kan patronen vändas för att tömma lagret buffert från dessa avdelningar.
  4. Förbered kassetten för lastning genom att lägga GELFREE löpande buffert till varje patron kamrarna enligt följande:
GELFREE bläckpatron avdelningen Volym av GELFREE löpande buffert för att lägga till
Anod bufferttanksystem 8 mL
Cathode bufferttanksystem 6 ml
Insamling kammare 100 mikroliter varje
  1. Ta bort och kasta eventuella buffert från provet lastning kammaren.
  2. Ladda 150 mikroliter prov till lastning kamrarna med en 8-kanals pipett.
  3. Placera den laddade patronen i GELFREE 8100 Fraktionering Station. Sänk elektroden matriser och stäng locket.

3. Köra patronen

  1. Använder instrumentet pekskärm, tryck metoden för att visa listan över förprogrammerade metoder. Var och en av de förprogrammerade metoder består av inställd spänning och tidsbaserade pauser syftar till att lösa proteiner inom en viss rad molekylvikter. Den GELFREE 8100 kommer automatiskt paus för bråkdel samling med de intervall som anges i metoden.
  2. När lämplig metod har identifierats, tryck på hämta-knappen och ange numret för den önskade förprogrammerade metoden att använda knappsatsen på skärmen. Tryck på OK och sedan på knappen Verkställ. Den metod som har använts kommer att visas längst ner på huvudskärmen.
  3. För att välja kanaler (antal prover) som kommer att användas under tiden, tryck på kanal-knappen på huvudskärmen. Du vill markera alla åtta kanaler trycker du på Välj alla. Sedan trycker du på Klar för att återgå till huvudskärmen.
  4. Se till att säkerheten locket är stängt och att indikatorn lyser grönt längst ner på skärmen.
  5. Till att börja proteinet separation, tryck på start. Fraktionering Station kommer automatiskt att pausa när det är dags att samla fraktioner. OBS: När systemet är igång, cirklarna visas i rutan på vänster sida av skärmen visar status för varje kanal. En grön cirkel visar att kanalen är aktiv, visar en gul cirkel som instrumentet har paus, och en röd cirkel anger att kanalen har misslyckats. Tillämpade spänningar och strömmar visas till höger på cirklarna kanalstatus. Bråk bör endast tas bort när statusen cirklarna har vänt gul och en text varning visas på instrumentets skärm.
  6. För att ta bort fraktioner, öppna locket på instrumentet och använda ett 8-kanals pipett att dra tillbaka 150 mikroliter från varje kollektion kamrarna.
  7. När fraktioner har tagits bort, tvätta uppsamlingsbehållaren två gånger med GELFREE löpande buffert genom att tillsätta 100 l per kanal och pipettera upp och ned två gånger.
  8. Efter tvätt, lägga 100uL av GELFREE löpande buffert tillbaka in i samlingen kamrar, stäng locket och tryck knappen Fortsätt.
  9. Den GELFREE 8100 kommer att pågå fram till nästa tidsintervall. Den totala tiden som återstår i experimentet visas på höger sida av skärmen. För att växla mellan återstående tid, tid som förflutit, och tid att pausa, tryck på knappen ovanför rutan visar tiden.
  10. När alla fraktioner har samarbetellected kan de omedelbart att användas för vidare beredning, såsom isoelektrisk fokusering eller gelelektrofores, eller för analys med flytande spektrometri kromatografi vikt eller immunoaffinity.

4. Representativa resultat

En 200 mikrogram av nötkreatur lever homogenatet delades in i 12 fraktioner varje, med hjälp av GELFREE Fraktionering System. 6 mikroliter av varje fraktion kördes på en standard 1D SDS PAGE gel och silver färgade. Som visas i figur 1, var det protein provet fraktionerade i 12 olika fraktioner, som spänner över molekylvikt varierar från 3.5kDa till 150kDa. En molekylvikt standard (ColorBurst, Sigma) visas också i körfält 1 och 14. Gelen visas här belyser hög återvinningsgrad uppnås med GELFREE 8100-systemet för protein fraktionering. Gelen som visas här representerar 4% av proteinet återhämtat sig från 200 mikrogram.

Figur 1
Figur 1. Proteiner från nötkreatur lever homogenatet separeras med hjälp av GELFREE Fraktionering systemet. 6 mikroliter av varje 150 mikroliter fraktionen var laddas och körs på en 1D SDS PAGE gel och silver färgade. En molekylvikt (MW)-standarden var också laddad som anges. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Discussion

Den GELFREE 8100 Fraktionering System ger en snabb, enkel och reproducerbar metod för partitionering komplexa protein prover i separata molekylvikt-baserade fraktioner. Denna nya metod för fraktionering eliminerar behovet av band eller plats skärning, vilket gör det möjligt att isolera proteiner över ett brett massa intervall i 90 minuter. Möjligheten att läsa in relativt stora mängder av prov och återhämta fraktioner i flytande fasen är särskilt användbart i isolering och analys av låg överflöd proteiner, som vanligtvis svårare att upptäcka. Den resulterande fraktioner kan sedan användas i en mängd tillämpningar, såsom LC-MS, MALDI-TOF-och immunoblotting.

Disclosures

Författarna av denna artikel är anställda av Protein Discovery som producerar reagens och instrument som används i denna artikel.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter