Relata-se o desenvolvimento de um sistema automatizado para geração de imagens e análise de zebrafish embriões transgênicos em placas de vários poços. Isso demonstra a capacidade de medir os efeitos dose-dependente de uma pequena molécula, BCI, na expressão do gene Fator de Crescimento de Fibroblastos repórter e fornecer tecnologia para o estabelecimento de high-throughput telas química zebrafish.
Nós demonstramos a aplicação de baseada em imagem de alta teor de metodologia de triagem (HCS) para identificar as moléculas pequenas que podem modular a via de FGF / RAS / MAPK em embriões de peixe-zebra. O embrião do zebrafish é um sistema ideal para in vivo telas de alto conteúdo químico. O embrião de 1 dia de idade é de aproximadamente um milímetro de diâmetro e pode ser facilmente dispostas em placas de 96 poços, um formato padrão para a triagem de alto rendimento. Durante o primeiro dia de desenvolvimento, os embriões são transparentes com a maioria dos principais órgãos presentes, possibilitando a visualização da formação de tecido durante a embriogênese. A automação completa de telas química zebrafish ainda é um desafio, no entanto, particularmente no desenvolvimento de aquisição de imagem e análise automatizada. Nós já gerou uma linha de repórter transgênico que expressa a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle da atividade FGF e demonstraram sua utilidade em telas de química<sup> 1</sup>. Estabelecer metodologia para a alta taxa de telas organismo inteiro, desenvolvemos um sistema automatizado para geração de imagens e análise de embriões zebrafish em 24-48 horas após a fertilização (hpf) em placas de 96 poços<sup> 2</sup>. Neste vídeo podemos destacar os procedimentos para arraying embriões transgênicos em placas de vários poços em 24hpf ea adição de uma pequena molécula (BCI) que hyperactivates sinalização FGF<sup> 3</sup>. As placas são incubadas por 6 horas seguido pela adição de tricaina para anestesiar as larvas antes da imagem automatizados em um Molecular Devices ImageXpress Ultra confocal de varredura a laser HCS leitor. As imagens são processadas pelo software Definiens desenvolvedor usando um algoritmo de Cognition Network Technology que desenvolveu para detectar e quantificar a expressão de GFP na cabeça de embriões transgênicos. Neste exemplo, destacamos a capacidade do algoritmo para medir efeitos dose-dependentes da BCI na expressão do gene GFP repórter em embriões tratados.
Um fator importante limitar a taxa de telas química zebrafish é a falta de metodologia para processar sistematicamente placas de 96 poços para a imagem latente e análise. Porque as imagens de organismos multicelulares são contraste, complexos de baixa, e de natureza heterogénea, algoritmos de análise de imagem existentes não conseguem detectar e quantificar estruturas específicas dentro do organismo. A maioria das telas química publicada zebrafish, portanto, envolverá a análise visual de poços individuais por pessoal dedicado durante todo o procedimento. Isso geralmente impede a geração de leituras numéricas e um completo arquivo de imagens da tela e dados. Além disso, avaliação manual elimina várias vantagens importantes da imagem baseada em triagem, ou seja, a capacidade de realizar análises retrospectivas de desempenho da tela, para examinar as mudanças fenotípicas que não eram o foco principal da campanha de triagem (por exemplo, toxicidade, ou defeitos de desenvolvimento) e para cruzar -dados de referência de triagem com telas de passado ou futuro usando a biblioteca mesmo composto.
Neste relatório, destacam-se metodologia para geração de imagens e análise automatizada de embriões em placas de zebrafish vários poços sem intervenção do usuário. Nós captura de imagem automatizados em um laser Ultra ImageXpress varredura confocal leitor (dispositivos Molecular, Sunnyvale, CA) para a imagem Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embriões em 96 placas bem e desenvolveu um algoritmo de análise de imagem com base em Rede Definiens "Cognição Tecnologia que GFP quantificados expressão nas cabeças dos embriões transgênicos. O método fornecido respostas classificados e quantificados a atividade in vivo de uma pequena molécula ativador da FGF sinalização. Resultados semelhantes foram obtidos com o epifluorescência baseado ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) documenta que é possível implementar a captura de imagem automatizado de embriões zebrafish em uma variedade de leitores de placas disponíveis comercialmente 2. O desenvolvimento de metodologia para analisar automaticamente imagens organismo multicelular eliminou a necessidade de marcar visual por um observador humano e permitiu a geração e arquivamento de dados numéricos e imagens para análise retrospectiva e comparações com telas futuro.
Este trabalho é financiado pelo NICHD / NIH (1R01HD053287) para Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) para Vogt, e NHLBI / NIH (1R01HL088016) para Tsang.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |