Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

الإلكترون Cryotomography من الخلايا البكتيرية

doi: 10.3791/1943 Published: May 6, 2010

Summary

نحن هنا لتوضيح كيفية استخدام الإلكترون cryotomography (ECT) لدراسة التركيب الدقيق للخلايا بكتيرية في القريب الناطقين الدول ، والى "الجزيئات" (~ 4 نانومتر) القرار.

Abstract

بينما هو معروف بالفعل الكثير عن عملية الأيض الأساسية من الخلايا البكتيرية ، والعديد من المسائل الأساسية لا تزال دون جواب من المستغرب ، بما في ذلك على سبيل المثال الطريقة التي تولد والحفاظ على أشكال معينة من الخلايا ، ووضع الاقطاب وعزل العوامل الوراثية الخاصة بهم ، والانقسام. من أجل فهم هذه الظواهر ، لا بد من تقنيات التصوير التي من شأنها سد الفجوة بين القرار ومضان المجهر ضوء دقة أعلى أساليب مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي الطيفي.

الإلكترون cryotomography (ECT) هو التكنولوجيا الناشئة التي لا فقط هذا ، والسماح للالترآيب الدقيق للخلايا أن تصور في حالة شبه الأصلي ، في الأبعاد الثلاثة (3D) ، مع القرار "الجزيئات" (~ 4nm) 1 و 2 في العلاج بالصدمات الكهربائية ، وتصوير الخلايا في الجسم الزجاجي "رطب مجمدة" في حالة البرد المجهر الإلكترون انتقال (cryoTEM) في درجة حرارة منخفضة (<-180 درجة مئوية). مرهف لخلايا (إلى ~ 500 نانومتر في سماكة 3) ، وخلايا سليمة ويغرق المجمدة داخل وسائل الإعلام عبر شبكات EM في cryogens مثل الإيثان او الايثان / البروبان الخلائط. ويمكن أيضا سمكا الخلايا والأغشية الحيوية يمكن تصوير في حالة الزجاجي أولا عن طريق "تجميد عالية الضغط" ، ثم "البرد sectioning" لهم. ثم يتم جمع هذه سلسلة من الصور ثنائية الأبعاد الإسقاط من خلال العينة كما هو يميل تدريجيا على طول محاور واحد أو اثنين. ويمكن بعد ذلك إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد ، أو "صورة مقطعية" تحسب من الصور. في حين يتطلب العلاج بالصدمات الكهربائية الأجهزة باهظة الثمن ، في السنوات الأخيرة ، تم استخدامه في بعض المختبرات للكشف عن هياكل الزوائد الخارجية المختلفة ، وهياكل من المغلفات الخلية المختلفة ، والمواقف والهياكل من خيوط هيكل الخلية ، ومواقع وأبنية من الجزيئات الكبيرة جمعيات مثل المحركات سوطي ، المقصورات الداخلية والمصفوفات مستقبلة كيميائية 1 ، 2

في هذه المقالة نوضح الفيديو كيفية خلايا صورة مع العلاج بالصدمات الكهربائية ، بما في ذلك عمليات إعداد العينات ، وجمع البيانات ، وإعادة بناء صورة مقطعية ، وتفسير النتائج من خلال تجزئة والترابط في بعض الحالات مع المجهر الضوئي.

Protocol

أولا التحضير للثقافة الخلية البكتيرية

  1. تنمو الخلايا البكتيرية في وسائل إعلامها الطبيعي أن المطلوب في المرحلة ثقافة مل السائل قليلة. اذا كانت هناك حاجة تركيز أعلى ، والغزل ، ويمكن اعتماد إعادة تعليق في وسائل الإعلام الجديدة ، ولكن كن على علم بأن هذه العملية في بعض الأحيان يدخل تغييرات هيكلية في الخلايا.
  2. الاختيار في ضوء المجهر للتأكد من أن الثقافة هي خالية من الملوثات وفي إحدى التقاء المناسبة.
  3. يمكن لبعض الخلايا البكتيرية عصا أو حتى تنمو على شبكات EM. عندما وغالبا ما تستخدم الخلايا المتزايد على شبكات ، وشبكات الذهب مع معطف الكربون لتجنب سمية للخلايا. ينبغي أن تكون فارغة توهج لمدة 2 دقيقة ، وتعقيمها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة ، ووضعها مباشرة في ثقافة السائل. والخلايا الملتصقة عصا بطبيعة الحال إلى الشبكة ، ويمكن دفع الآخرين للانضمام إلى الشبكة عن طريق الشبكة في طلاء 0.1 ٪ بولي - L - يسين الأولى. التحقق من شبكات في ضوء المجهر أولا للتأكد من تركيز الخلايا غير مناسبة قبل التجميد.

II. يغرق تجميد الخلايا رقيقة

لخلايا بكتيرية رقيقة ، وتعليق من خلايا سليمة هو يغرق المجمدة عبر الشبكة EM. عملية يحافظ على بنية فائقة للخلايا البكتيريا ويمنع تبخر المياه في الفراغ العالية للEM في وقت لاحق. ويمكن أن يتم ذلك إما مع العرف صنع أجهزة تجميد يغرق ، أو 4 كما نعرض هنا ، مع انخفاض التلقائي الفريزر التجاري ، الاتحاد الدولي للفروسية Vitrobot MKIII.

  1. توهج تصريف الكربون المغلفة شبكة EM لمدة 2 -- 4 دقيقة. وهذا يجعل سطح الشبكة المائية ، مما يساعد على انتشار العينة بالتساوي عبر الشبكة بأكملها.
  2. مزيج 100μl حل الذهب الغروية (قطره 10 نانومتر الجسيمات) مع 25μl حل جيش صرب البوسنة تتركز 5 ٪. المعاطف BSA جزيئات الذهب وهذا يمنع التجميع الخاصة بهم.
  3. أجهزة الطرد المركزي لجيش صرب البوسنة والذهب المخلوط الجسيمات في 18000g لمدة 15 دقيقة. بعد إزالة طاف ، يخلط ما تبقى من الذهب بيليه برصيد 20 ميكرولتر حل الخلية. جزيئات الذهب BSA معاملة لا تتفاعل مع الخلايا ، ولكن ستكون هناك حاجة لأنها علامات إيمانية لاعادة اعمار tomograms.
  4. 4 تطبيق ميكرولتر من الخلية والذهب المخلوط حل للتوهج تفريغها EM الشبكة في Vitrobot في الرطوبة 100 ٪. ومن ثم نشف الشبكة تلقائيا من كلا الجانبين مع ورقة 1 العدد مرشح. يزيل هذا السائل الزائد ، بحيث سوى طبقة رقيقة من الخلايا في وسائل إعلامها لا يزال قائما. ومن ثم انخفض بسرعة الى الشبكة خليط سائل من الإيثان والبروبان الذي يتم تبريده إلى ما يقرب من 77K مع النيتروجين السائل. خلال هذه العملية ، يتم تجميد العينات بسرعة كبيرة بحيث يتم منع تشكيل بلورات الجليد في الأغشية الرقيقة <1 ميكرون.
  5. إزالة بعناية الشبكة من خليط الايثان / البروبان ونقل بسرعة الى الشبكة مربع التخزين التي يتم الاحتفاظ بها تحت النيتروجين السائل.

III. ارتفاع الضغط وتجميد كرو Sectioning أثخن من خلايا

لخلايا سمكا ، وارتفاع ضغط يقلل تجميد بلورة الثلج والبرد اللاحقة sectioning يجعل عينات رقيقة بما يكفي لتصوير EM 5 ، 6 ، 7 وهناك العديد من أصحاب العينات المختلفة المتاحة لتجميد ارتفاع الضغط ، وسوف يعتمد اختيارك على العينة ، ونوع آلة التجميد المستخدمة أو اختيار التطبيق التحقيق. هنا نستخدم بال تيك HPM 010 الفريزر ارتفاع الضغط والبرد المتطرف مشراح UC6/FC6 من طراز لايكا مايكروسيستمز.

  1. للبكتيريا ، تؤخذ 15mls الدوار الثقافة OD> 0.5 مباشرة من الحاضنة 37 درجة مئوية ، وطرد في 1000rpm لمدة 3 دقائق. بعد إزالة طاف 0.5ml مزيج من الثقافة وبيليه المتبقية مع 0.5ml من cryoprotectant ديكستران 20 ٪ ومن ثم الطرد المركزي في 13000rpm لمدة 15 ثانية.
  2. بعد إزالة طاف ، 0.1ml ماصة لبيليه سوبر صقها في تلميح micropipette حرارة مختومة الذي يحتوي بالفعل على 20 ٪ 0.2ml ديكستران cryoprotecant (40000Mwt). الطرد المركزي الخليط في الطرف micropipette 13000 دورة في الدقيقة في مدة 30 ثانية ، وإزالة طاف. وينظر إلى بيليه 50-10 ميكرولتر مشددة على الحافة مختومة.
  3. A "تفلون" ذي القبة النحاسية المغلفة شنت ملوحة جاهزة في ذراع الضغط العالي حامل المجمد يتلقى صقها في نصف قبة ، ومختومة مع شريك لها شقة قبعة النحاس.
  4. ثم يتم تجميع ذراع إدراجها على الفور في الفريزر الضغط العالي معبي مستعدة لتجميد.
  5. عند ضغط 2100 بار يتم تبريده بسرعة ملوحة النحاس الجمع بين وحدة تحتوي على الخلايا بواسطة طائرة من ارتفاع ضغط النيتروجين السائل ، وإزالة التجميع الذراع على الفور وتغرق في حمام من النيتروجين السائل يمنع ملوحة الناجمة عن الاحتباس الحراري.
  6. يتم تخزين وحدات ملوحة تحت النيتروجين السائل حتى اللازمة لsectioning البرد.
  7. لفضح قبة جيدا من الخلايا المجمدة لsectioning ، يتم فصل بعناية planchets النحاس two undeص النيتروجين السائل.
  8. القبة مجمدة تماما من الخلايا هو زجاجي في المظهر وخالية من الشقوق والصدوع التنوي الجليد.
  9. يتم نقل هذه ملوحة إلى -170 درجة مئوية precooled الغرفة ومثبتة على تشوك نائب مثل البرد مشراح.
  10. ويحتوي cryomicrotome تبريد cryotools الأساسية اللازمة لsectioning ، وهذه تشمل : انخفاض زاوية البرد الماس سكين ، أداة الماس التشذيب ، ومنصة الصحافة ، شبكة تخزين مربع ، وهي وحدة رش لمكافحة ساكنة وجهاز الشبكة القابضة.
  11. لنجاح الشريط sectioning منطقة القبة الخارجي في البداية على شكل مربع ل<0.2mm بواسطة أداة الماس التشذيب وبسرعة كبيرة sectioning مع الإبقاء على عمق ~ 200μm محيط المجمدة جيدا.
  12. مع رذاذ الاستاتيكيه الموجهة السكين زاوية منخفضة ، وشبكات الدعم النحاس على مقربة ، والماس هو سكين المتقدمة بعناية لمواجهة كتلة مصقولة تجهيزها للsectioning.
  13. ويتم اختيار المعلمات مشراح ، مثل وضع سمك المقطع ما بين 50 و 350 نانومتر ، جنبا إلى جنب مع سرعة قطع 0.4mm/sec ~ وتضييق إطار القطع. من المهم للسيطرة على مجموعة رذاذ الاستاتيكيه وكثافة لظروف انخفاض نسبة الرطوبة في المنطقة المجاورة.
  14. كما يتم إنتاج المقاطع الأول هو ناور قضيب رمش غرامة باليد أو لعطل micromanipulator المقاطع المبكر انزلاق الماس زاوية منخفضة حافة السكين.
  15. في حين يتم فرض الشريط من أبواب الخروج من سكين ، معتمدة من قبل بلطف تحقيقا رمش ويسترشد عبر الشبكة النحاسية الدعم القريبة.
  16. التمسك المقاطع ، ومن ثم الشبكة محملة شرائط ضغطت بشدة باستخدام مبرد مصقول والفضة التحقيق ، وحتى بعض أجزاء مشحونة بأحدث الأجهزة الاستاتيكيه قد تساعد في عملية الالتصاق.
  17. تبقى مربعات الشبكة للتخزين على المدى الطويل في النيتروجين السائل حتى يبرد الشاحن الجافة المجهر مستعدة لنقل الشبكة.

رابعا. فحص الخلايا باستخدام مجهر الضوء كرو

ولا يمكن تصوير الخلايا البكتيرية على الشبكة باستخدام المجهر البرد الخفيفة (cryoLM). المجهر نستخدم هنا هو مخصص نيكون المجهر المقلوب تي E / B مع مسافة اضافية العمل الطويلة (ELWD) 60x عدسة الهدف الهواء. يتم الاحتفاظ الشبكات في مرحلة البرد أثناء التصوير ، والتي هي مرحلة الاتحاد الدولي للفروسية لتعديل البرد المجهر الخفيفة. باستخدام شبكة مكتشف ، ويمكن أن يكون موجودا في الخلايا على المربعات الشبكة وتكون مرتبطة الصور cryoLM إلى tomograms cryoEM.

  1. تحميل شبكات في خراطيش البرد على المحطة. خراطيش هي العادة معدلة من خرطوشة لدينا EM القياسية للاتحاد الدولي للفروسية TF30H - polara. تعقد الشبكة بنسبة مقطع حلقات النحاس. ثم يتم الاحتفاظ خرطوشة في أنبوب في النيتروجين السائل لنقل.
  2. تبريد وصولا الى مرحلة البرد حرارة النتروجين السائل (-190 درجة مئوية).
  3. تحميل خرطوشة في مرحلة البرد ونقل الشبكة في إطار العرض. يمكن أن تعقد ما يصل إلى مرحلة خراطيش مخصصة two تعديلها.
  4. انخفاض العدسة مكثف وتركيز العدسة على الهدف 60x الشبكة.
  5. العثور على الخلايا والتقاط الصور. لLM ارتباطا ودراسة EM ، يتم فحص الشبكة في جميع أنحاء المنطقة من الخلايا ، لتحديد موقع الخلايا في وقت لاحق EM.
  6. بعد التصوير الشبكة ، وضع خرطوشة مرة أخرى إلى الأنبوب والحفاظ على أنبوب في النيتروجين السائل حتى تكون جاهزة للتصوير في EM.

خامسا جمع سلسلة الخيمة في TEM كرو

للحصول على صورة مقطعية 3D من الخلية البكتيرية ، واتخذت سلسلة من الصور الإسقاط بينما يميل تدريجيا نموذج واحد أو على طول محورين في TEM البرد. نظرا للإمالة وضبط زوايا تجريبية أخرى ، وهناك العديد من البرامج المختلفة المتاحة لتحصيل تلقائيا سلسلة الميل. نستخدم Leginon لدينا البرد تيم الاتحاد الدولي للفروسية التي TF30H - polara. أنها تسمح لاتخاذ سلسلة الميل تلقائيا من الخلايا انتقاؤه 8

  1. تحميل خراطيش في حامل متعدد التحديد (MSH) على محطة precooled البرد. يمكن أن تعقد ما يصل إلى MSH 6 خراطيش.
  2. توصيل MSH إلى TF30H - polara ، واختيار خرطوشة واحدة ، وإدراجه في العمود EM.
  3. بدء Leginon - العميل على جهاز الكمبيوتر وEM Leginon البرنامج الرئيسي على محطة العمل الأخرى.
  4. إعداد الإعدادات المسبقة (شروط الصورة) لدورة Leginon. معلمات هامة هي التكبير ، والتركيز في إطار القيمة ، فإن الجرعة الإلكترون وزوايا الميل لسلسلة الميل ، بما في ذلك بدء زاوية ، زاوية النهاية والعلاوات.
  5. اختيار الأهداف على الصور بدءا من أدنى التكبير وإرسالها إلى الخطوة التالية مع ارتفاع التكبير.
  6. يصطف جميع أهداف لإمالة سلسلة جمع ويقدم كل منهم للدور النهائي الخطوة "المقطعي".
  7. ويمكن رصد عملية جمع البيانات عن طريق أداة على شبكة الإنترنت من محطة العمل المحلية.
  8. بعد الانتهاء من جمع البيانات التجريبية ، بانخفاضتحميل أكملت سلسلة إمالة على محطة عمل محلية لاعادة الاعمار.

سادسا. اعتبارات السلامة الأحيائية

معظم العينات البيولوجية التي نعمل بها هي غير المسببة للأمراض وتم عزلها من التربة ، وماء الصنبور أو القناة الهضمية للحشرات. تقنية العقيم الأساسية هي كافية للتعامل مع هذه العينات. العمل مع مسببات الأمراض يتطلب تنفيذ خطوات إضافية للسلامة ، ولكن لمخاطر المدقع ، وبعض المعامل قد قمت بتثبيت كامل البرد EM المجاهر داخل BSL - 3 مختبرات. وفيما يلي بعض الطرق التي قللت من خطر من العمل مع الممرضة في المختبر.

  1. يمكن أن تسببها عينة يمكن الموهن إما كيميائيا أو وراثيا. لقد فعل الكثير من المعامل المعطلة البرد EM فيروسات لهم مثبتات الكيميائية قبل تجميد - يغرق. كبديل ، يمكن عرض الطفرات الرئيسية التي تجعل هذه العينات غير المعدية ، بما في ذلك على سبيل المثال تعطيل الطفرات نقطة في إنزيمات معينة أو ضرب المستقبلات.
  2. وينبغي ارتداء معدات الوقاية الشخصية مثل القفازات ، معطف المختبر ونظارات واقية.
  3. يمكن التعامل مع العينات الخطرة في خزانة السلامة الأحيائية (BSC). يمكن زراعتها الثقافات البكتيرية ، ومركزة ، وحتى يغرق المجمدة على شبكات EM في ش. لدينا ، أصغر دليل يغرق - تجميد الجهاز الذي يلائم BSC لدينا لهذا الغرض. اذا كانت هناك حاجة لمزيد من الاتساق التي تتيحها آلية التجميد ، يمكن أن يغرق ، إما أن تكون أدخلت على BSC ، أو ، ببساطة أكثر ، في بعض الحالات لدينا مدعومة من منصات النشاف Vitrobot دينا برقائق الألومنيوم لمنع التلوث من الجهاز. وينبغي تطهيرها عند العمل مع ش ، حيث أن الكثير من الأدوات والمواد ممكن تسير داخل أو خارج مجلس الوزراء مع الايثانول 70 ٪. عند إعداد الشبكات لدينا ، ونحن استخدام كميات صغيرة من ثقافة البكتيرية أو الفيروسية (عادة 4 ماي) ، ومعظمها يحصل نشف بواسطة ورقة Whatman. يتم التخلص من الورق النشاف ، نصائح ماصة ، والثقافة المتبقية من biohazardous كنفايات. يتم تطهير جميع الأدوات والأسطح المكشوفة مع التبييض المخفف ، والإيثانول بنسبة 95 ٪ ومن ثم المياه.
  4. حالما يتم تجميد الشبكات ، واستمروا في درجات حرارة النتروجين السائل في جميع أنحاء جمع البيانات وتخزينها. وقد تبين أن الخلايا يمكن البقاء على قيد الحياة تجميد ثم ذوبان ، ورغم ذلك نستمر في التعامل معها على أنها خطرة خلال جمع البيانات وتخزينها. في نهاية جمع البيانات ، وتتم إزالة الخراطيش تحتوي على شبكات المجمدة من البرد تيم وانخفض مباشرة في الكحول 70 ٪. بينما نادرة ، ينبغي الإشارة إلى أنه في بعض الأحيان يتم "إسقاط" شبكات داخل العمود ، وينبغي التفكير في العواقب المترتبة على مثل هذا الحدث عن كل عينة الخطرة. معظم المجهر هو في درجة حرارة الغرفة ، وبالتالي فإن نموذج على شبكة وانخفض احتمال ذوبان الجليد داخل العمود وتصبح المجفف تماما في خواء تام من EM. هذا من شأنه أن يعطل بعض العينات البيولوجية واضح ، ولكن ربما لا يحتمل فيروسات قوية ، وبقايا المجفف من العينة أن أفرج عن الهباء المقبل عند فتح العمود المجهر للخدمة.

سابعا. صورة مقطعية إعادة الإعمار

يتم بناؤها في tomograms من الخلايا البكتيرية من خلال البرنامج. هناك العديد من البرامج المتاحة لهذه المهمة. نستخدم رابتور لإعادة الإعمار والتلقائي tomograms الفرز. الآلي و9 محاذاة سلسلة مغطاة وإعادة الإعمار اللاحقة مهمة غير هينة ، رابتور حاليا لا يملك نسبة النجاح 100 ٪. في حالة فشل رابتور أو الحاجة إلى إعادة بناء ذات جودة عالية ، ونحن نستخدم دليل محاذاة الصورة واعادة الاعمار مع eTomo في برنامج جناح التصوير المقطعي IMOD 10 ، 11

  1. تحميل كل الميل سلسلة فردية من خادم ويب Leginon المحلية. حفظها في الدليل حيث يمكن بسهولة أن تكون موجودة.
  2. تفتيش يدويا باستخدام سلسلة الميل المشاهد في IMOD 3dmod وتجاهل تلك Leginon عندما فشلت تتبع الهدف أو الميل إنتاج سلسلة مفيدة.
  3. نركض رابتور موزعة على آلات لينكس في المختبر من خلال الخوخ (نظام قائم على بيرل توزيع المهام عبر شبكة اتصال). علينا تحديد حجم علامات إيمانية لدينا ، أي جزيئات الذهب الغروية ، وعدد من العلامات التي ستستخدم لإعادة الإعمار ، وحجم البكسل ، سمك المرجوة من إعادة الإعمار ، وعامل binning وعدد من الإعدادات الأساسية (مثل الإدخال ، مسارات الانتاج وتنسيق الإخراج) على سطر الأوامر وترك الأمر لتشغيل ، ل2H 20min عموما عن 122 مجموعة البيانات والصورة (2K بواسطة 2K). إذا كان راض عن نتيجة اعادة الاعمار ، يمكن تخطي الخطوات التالية في هذا القسم.
  4. عندما تكون هناك حاجة دليل الإعمار ، إعادة تسمية الملفات من "لجنة نهر الميكونج." إلى "ش" وتحميل الفرد سلسلة الميل إلى واجهة المستخدم الرسومية eTomo في IMOD جناح التصوير المقطعي.
  5. تحديد نوع الميل محور سلسلة (محاور واحد أو مزدوج) ، وأدخل حجم إيمانية المستخدمة في ساmple التحضير. مسح رأس الملف لتحديد حجم بكسل ، والمضي قدما بالنقر على "إنشاء البرامج النصية كوم".
  6. اتبع الخطوات في كل التبويب في واجهة المستخدم الرسومية eTomo لإعادة بناء صورة مقطعية من سلسلة الميل. تفتيش والتحقق من النتيجة بعد كل خطوة ، وإذا لم يكن راضيا ، لا يمكننا دائما العودة إلى أي الخطوة السابقة واعادة معالجة من هناك. "ما قبل المعالجة" هو تنفيذ معالجة التحضيرية وإزالة غير طبيعي بكسل عالية الكثافة التي تسببها الأشعة السينية. "محاذاة الخشنة" تنتج سلسلة الميل حيث يتم محاذاة كل صورة الإسقاط لاحقة في سلسلة الميل إلى سابقة ارتباط المتبادل. نحدد حبات الذهب الذي لاستخدام fiducials في "الجيل النموذجي إيمانية" ، وبرنامج المسارات علامات إيمانية في كل صورة الإسقاط ويبني "محاذاة الجميلة". "صورة مقطعية لتحديد المواقع" يسمح اقتصاص صورة مقطعية في Z. "الانحياز النهائي المكدس" يتم إنشاؤها باستخدام الخطية ، وظائف مثل CTF - التصحيح ، وذهب ممحاة ويمكن تطبيقها 2D تصفية اختياريا. يحسب صورة مقطعية في "إنشاء صورة مقطعية" من المرجح الإسقاط الخلفي في الفضاء فورييه. "بعد معالجة" يمكن الاقتصاص من صورة مقطعية لمنطقة - XY من الاهتمام وتوسيع نطاق التباين في مجموعة من هياكل الفائدة ، و "تنظيف" حذف الملفات المتوسطة ويحرر مساحة القرص.

ثامنا. تخزين في قاعدة بيانات Tomograms

نستخدم شبكة الإنترنت في المنزل قاعدة بيانات لتنظيم وتخزين والبحث ، وتوزيع بيانات تصوير الشعاعي الطبقي. لكل سلسلة الميل ، ويمكن أن نسجل تفاصيل العينة ، جمع المعلمات المجهر ، سلسلة الخام ، فضلا عن الميل المرتبطة 3D اعادة الاعمار ومعالجة ملفات أخرى. الصفحة الرئيسية التصفح ويعرض صورة مصغرة ، ويمكن تنظيم مميزة "يوتيوب" على غرار فيلم عن كل صورة مقطعية ، وإدخالات تردد من قبل التحميل ، خالق نوع العينة ، أو التاريخ. يمكن للمستخدمين البحث في قاعدة البيانات عن طريق إدخال كلمات رئيسية أو ميزات خاصة. حاليا تم إيداع أكثر من 4500 ميل سلسلة تصوير الشعاعي الطبقي في قاعدة البيانات ، التي تغطي ما يقرب من 60 نوعا من الأنواع / العينة ، مع ما مجموعه أكثر من 11000 الملفات المرتبطة بها.

تاسعا. تحليل والإنقسام من Tomograms

  1. ويمكن الاطلاع على تفاصيل الهيكلية للtomograms وتحليلها من خلال برامج مختلفة مع أدوات معالجة الصور ، مثل المشاهد من 3dmod IMOD مع ZAP ، XYZ ونافذة القطاعة.
  2. والخطوة التالية هي لإنشاء تجزئة صورة 3D (صورة مقطعية). ويسند إلى تجزئة كل فوكسل (بكسل الحجمي) للصورة 3D تسمية المنطقة التي تصف أو المواد فوكسل ينتمي إليها ، على سبيل المثال ، أو غشاء الهيكل الخلوي ملف. نستخدم أدوات البرمجيات مثل 3dmod في IMOD وأميرة (التصوير سيماء).
  3. على الرغم من أن بعض أدوات برامج توفير وحدات التقسيم التلقائي (على سبيل المثال ، وتجزئة العتبة) ، فإنها غالبا ما تعمل فقط للصور ذات التباين العالي. 3D الصور المستمدة من cryotomography الإلكترون جرعة منخفضة وعلى النقيض من هذا القبيل منخفضة أنه في معظم الحالات لدينا لتعيين يدويا تسمية إلى كل فوكسل.
  4. يتم تخزين التجزئة في ملف بيانات منفصلة. يمكن استخدامه لتوليد نموذج السطح الذي يظهر في كل منطقة بلون مختلف ، وينظر في 3D.
  5. يمكن أن تستخدم لتحليل tomograms الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن للمطابقة قالب وحساب العائد المعلومات الإحصائية اللاحقة لمجمع الجزيئات مثل ريبوسوم. Subvolume المحاذاة والمتوسط ​​يظهر تباين أعلى في الهياكل ويكشف التفاصيل الدقيقة.

عاشرا صناعة الأفلام على أساس tomograms

نحن صنع أفلام لتلخيص كل مشروع وإعطاء جولة البصري للصور تصوير الشعاعي الطبقي لدينا.

  1. جعل النصي من الميزات في البيانات نود أن تظهر وكيفية جعل هذه الميزات. على سبيل المثال ، في فيلم نموذجي لمشروع التصوير المقطعي خلية كاملة ، ونحن نبدأ من خلال عرض سلسلة البيانات وممثل صندوق خلفي ثم اتبع مع وجهة نظر شريحة من قبل شريحة مقطعية من إعادة بنائها. المقبل ، ونحن إظهار تجزئة الجزيئات الأساسية في الخلية ، على سبيل المثال ، محرك سوطي أو مستقبلة كيميائية معقدة أو خيوط عصاري خلوي. وأخيرا ، فإننا نستنتج مع نموذج عرض تفسير مثالي للالجزيئات التي ندرسها.
  2. وتستخدم الرسوم في البرنامج مثل التمثيل أو أميرة الوهم لتقديم أطر فردية لا يزال من الفيلم. نجتمع عادة أقصر من أفلام لقطات لتسهيل إدخال تغييرات على كل مقطع.
  3. استخدام البرمجيات التجارية الفيلم التحرير مثل أدوبي بريميير لتجميع الإطارات لا يزال في لقطات الفيلم ، ثم لقطات الفيلم في الفيلم النهائي.
  4. لقد بدأنا لإضافة الصوت الذي يروي الفيلم. السرد بمثابة "أسطورة فيلم" ويسمح للجمهور أن يجري التركيز على تقديم البيانات أثناء مشاهدة الفيلم.

الحادي عشر. الرسوم المتحركة

بصريالقص يتواصل دون الحاجة إلى معرفة مفردات معقدة من مجالات علمية محددة. مفاهيم بسيطة تصبح صعبة عندما تكون مصحوبة مظاهرة البصرية. هذه الممارسة لتوضيح الأفكار البيولوجية مع الرسوم الكاريكاتورية ليست جديدة. ومع ذلك ، إلا في العقد الأخير لديها أدوات متطورة من المهنية وإنشاء المحتوى تم 3D التي مورست على مهمة بناء الحركات العلمية. هناك الآن العشرات من الباحثين ترجمة بنشاط النظم البيولوجية في الرسوم المتحركة 3D الحيوية. وعرضت العديد من الصور المتحركة الجميلة على http://MolecularMovies.org . هذا الموقع أيضا يستضيف الدروس وتوزيع مجموعة أدوات مجانية لمعالجة الهياكل الجزيئية في أوتوديسك مايا. لفتح المحتوى 3D جناح المصدر ، خلاط ، ويحتوي على العديد من المستخدمين ولدت المستوردين PDB.

عملية صنع الرسوم المتحركة 3D ينطوي عموما ثلاث خطوات :

  1. النمذجة : نحن نستخدم الرسومات لتصدير البرمجيات تمثيل السطوح في التنسيقات التي يمكن استيرادها إلى مايا. هذه السطوح هي إما من الإنقسامات tomograms بناؤها ، على سبيل المثال ، والأغشية ، والحبيبات ، أو الخيوط ، أو تمثيل الأسطح الجزيئية. يتم تنفيذ الإنقسامات في صورة مقطعية أميرة ؛ تتولد الأسطح الجزيئية في الوهم أو VMD. يمكن استيرادها من الجزيئات الذرية تمثيلات مباشرة إلى مايا من ملفات PDB. مرة واحدة في النماذج داخل مايا ، قد يتم تعديلها ونسخها ، ووضعها بالشكل المناسب.
  2. موحية : يتم بناؤها تقليديا متحركة من جهة ، مع الفنان يدويا نقل الأجسام المتحركة ، وتسجيل سلسلة من الأطر الرئيسية. التطورات الجديدة في مجال البرمجيات 3D الرسومات تسمح الآن أن تتولد دينامية من الناحية الإجرائية ، عن طريق بناء وحدات في واجهات برمجة التطبيقات النصية.
  3. تقديم : ديناميات الإجرائية يمكن أن توفر الرسوم المتحركة مقنعة من العمليات البيولوجية الحيوية ، مثل الهيكلية التجميع الذاتي. بعد نظرا لصعوبة محاكاة النظم البيولوجية واقعيا ، لا تزال مبنية على غالبية الرسوم المتحركة 3D باستخدام التقنيات التقليدية الإطار الرئيسية. مرة واحدة في ديناميات النظام ، يمكن إضافة الشروح البصرية ، والقوام ، وتأثيرات الإضاءة. أخيرا ، تم اختيار طريق الكاميرا ويتم تقديم الرسوم المتحركة الانتهاء إلى فيلم.

Discussion

نعرض في هذه المقالة كيفية القيام الفيديو العلاج بالصدمات الكهربائية من الخلايا البكتيرية. محدودة المكان والزمان ، وتبين لنا سوى بروتوكول عام. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل في الصحف ، والمعلومات عبر الإنترنت أو غيرها من المصنوعات التي تقدمها للمعدات ومطوري البرمجيات ، ومجموعات بحثية من العلاج بالصدمات الكهربائية. اعتمادا على الأنواع البكتيرية المختلفة التي تمت دراستها ، والمعدات المستخدمة والاهتمام الهيكلية في الخلايا ، والبروتوكول والمعلمات التجريبية تحتاج إلى اختبارها وتحسينها.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح AI067548 R01 ، R01 GM081520 ، GM086200 R01 ، R01 AI049194 وP01 GM066521 لGJJ فضلا عن معهد هوارد هيوز الطبي ، معهد بيكمان في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، والهدايا للمن معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا غوردون وبيتي مور مؤسسة ومعهد Agouron. معتمد من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة MSL 2R37 - A1041239 - 06A1 إلى باميلا S. بيوركمان. لايكا مايكروسيستمز تقدم يرجى محتوى الفيديو لجمع cryosection. وجمعت نتائج ممثل primitia اللولبية والتي تتم معالجتها بواسطة غافن هاء ميرفي ، ونشرت في علم الأحياء المجهرية الجزيئية مع عنوان "الرواية من ultrastructures primitia اللولبية وآثارها على القدرة على الحركة". (مورفي ، G. آخرون ، مول. Microbiol 67 ، 1184-1195 ، 2008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 0.1% solution
MKIII Vitrobot FEI
Gold colloid solution Sigma-Aldrich G1527-25ml 10 nm
Bovine serum Albumin Invitrogen P2489 10%
Nr 1 Filter paper Whatman, GE Healthcare 1001 055
Dextran Sigma-Aldrich 31389 15-25%, MW 39000
Brass-domed planchet Swiss Precision Company
Bal-Tec HPm 010 high pressure freezer Leica Microsystems
Cryo-ultra microtome UC6/FC6 Leica Microsystems
Diamond cryo trim 45 Diatome
Static line II ioniser Diatome
CX100 Dry shipper Taylor-Wharton
MSH loading station Gatan
Ti E/B inverted microscope Nikon Instruments Custom
Cryo LM stage FEI Custom
TF30-polara FEI With UltraCam from Gatan
Amira Visage Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  2. Li, Z., Jensen, G. J. Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure. Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).
  3. Frank, J. Three-dimensional imaging of biological complexity. J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).
  4. Iancu, C. V. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285-294 (2001).
  6. Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator. J. Microsc. 224, 129-134 (2006).
  7. Pierson, J. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. J. Struct. Biol. 169, (2009).
  8. Suloway, C. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).
  9. Fernando, A. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
  10. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  11. Mastronarde, D. N. Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution. J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).
الإلكترون Cryotomography من الخلايا البكتيرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., McDowall, A., Dobro, M. J., Briegel, A., Ladinsky, M., Shi, J., Tocheva, E. I., Beeby, M., Pilhofer, M., Ding, H. J., Li, Z., Gan, L., Morris, D. M., Jensen, G. J. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943, doi:10.3791/1943 (2010).More

Chen, S., McDowall, A., Dobro, M. J., Briegel, A., Ladinsky, M., Shi, J., Tocheva, E. I., Beeby, M., Pilhofer, M., Ding, H. J., Li, Z., Gan, L., Morris, D. M., Jensen, G. J. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943, doi:10.3791/1943 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter