Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

doi: 10.3791/1943 Published: May 6, 2010

Summary

אנחנו כאן להמחיש כיצד להשתמש אלקטרונים cryotomography (ECT) כדי ללמוד את ultrastructure של תאים חיידקיים של כמעט ילידי מדינות, כדי "macromolecular" (~ 4 ננומטר) החלטה.

Abstract

בעוד הרבה ידוע כבר על חילוף החומרים הבסיסי של תאים חיידקיים, שאלות יסוד רבים עדיין ללא מענה מפתיע, כולל למשל איך הם יוצרים ולשמור צורות תאים מסוימים, להקים קוטביות, לבודד הגנום שלהם, ומחלקים. על מנת להבין את התופעות האלה, טכנולוגיות הדמיה כי יש צורך לגשר על הפער בין ההחלטה מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי רזולוציה גבוהה יותר שיטות כגון קריסטלוגרפיה רנטגן ספקטרוסקופית NMR.

אלקטרונים cryotomography (ECT) היא טכנולוגיה המתעוררים שעושה בדיוק את זה, המאפשר ultrastructure של תאים להיות דמיינו במצב כמעט טבעיות, בשלושה מימדים (3D), עם רזולוציה "macromolecular" (~ 4nm). 1, 2 ב ECT, התאים הם צילמו ב זגוגי, "קפוא hydrated" המדינה מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים cryo (cryoTEM) בטמפרטורה נמוכה (<-180 ° C). עבור תאים דקים (עד ~ 500 ננומטר עובי 3), תאים שלמים הם לצלול קפוא בתוך רשתות התקשורת ברחבי EM ב cryogens כגון אתאן או אתאן / פרופאן תערובות. תאים עבה biofilms יכול להיות גם צילמו במצב זגוגי על ידי "הקפאת בלחץ גבוה" הראשון ולאחר מכן, "cryo-חתך" אותם. סדרה של דו מימדי תמונות הקרנת נאספים אז דרך המדגם כפי שהוא מוטה באופן הדרגתי לאורך אחד או שני צירים. שחזור תלת ממדי, או "tomogram" אז יכול להיות מחושב מן התמונות. בעוד ECT דורש מכשור יקר, בשנים האחרונות, זה נעשה שימוש במעבדות ספורות כדי לחשוף מבנים של איברים חיצוניים שונים, מבנים של מעטפות תאים שונים, עמדות ומבנים של סיבים cytoskeletal, ואת המיקומים של ארכיטקטורות macromolecular גדול מכלולים כגון מנועים flagellar, תאים פנימיים מערכים chemoreceptor. 1, 2

במאמר זה אנו וידאו להמחיש כיצד תאים התמונה עם ECT, כולל תהליכים של הכנת המדגם, איסוף נתונים, שחזור tomogram, ופרשנות של התוצאות באמצעות פילוח וגם מתאם במקרים מסוימים עם מיקרוסקופ אור.

Protocol

I. הכנה של תרבית תאים חיידקיים

  1. לגדל תאים חיידקיים בתקשורת הרגילה שלהם לשלב הרצוי תרבות מ"ל מעט נוזלי. אם ריכוז גבוה דרוש, ספינינג מחדש ההשעיה בתקשורת טרי יכול להיות מאומץ, אבל להיות מודעים לכך שתהליך זה לפעמים מציג שינויים מבניים בתאים.
  2. בדוק במיקרוסקופ אור כדי לוודא התרבות ללא מזהמים בנקודת המפגש מתאים.
  3. כמה תאים חיידקיים יכולים להיצמד או אפילו לגדול על רשתות EM. כאשר התאים גוברת על רשתות, רשתות זהב עם מעיל פחמן המשמשים לעתים קרובות ביותר, כדי למנוע רעילות לתאי. הם צריכים להיות משוחררים זוהר במשך 2 דקות, מעוקרים תחת אור UV למשך 15 דקות, ממוקם ישירות לתוך התרבות נוזלי. תאים חסיד באופן טבעי מקל לרשת, ואחרים יכולים שתתבקש לדבוק לרשת על ידי ציפוי הרשת ב 0.1% פולי-L-ליזין הראשון. בדוק את רשתות במיקרוסקופ אור ראשון כדי לוודא את הריכוז של תאים מתאים לפני ההקפאה.

השנייה. הקפאת לצלול תאים דקה

עבור תאים חיידקיים דק, ההשעיה של תאים שלמים היא לצלול קפוא ברחבי הרשת EM. תהליך זה שומר על מבנה אולטרה של תאים חיידקים וימנע אידוי מים בוואקום הגבוהה של EM מאוחר יותר. זה יכול להיעשות גם עם מחוייט מכשירים הקפאת לצלול, או כפי שאנו מראים כאן, עם מקפיא לצלול מסחרי אוטומטי, פיי Vitrobot MKIII 4.

  1. פריקה זוהר מצופה פחמן EM רשת עבור 2-4 דקות. זה הופך את פני השטח של הרשת הידרופילי, ובכך מסייע באופן שווה להפיץ את המדגם ברחבי הרשת כולה.
  2. מערבבים 100μl פתרון זהב colloidal (קוטר החלקיקים של 10 ננומטר) עם 25μl של פתרון 5% BSA מרוכז. מעילים BSA חלקיקי זהב זה מונע הצטברות שלהם.
  3. צנטריפוגה BSA תערובת החלקיקים זהב 18000g במשך 15 דקות. לאחר הסרת supernatant, שנותרו הזהב גלולה הוא מעורבב עם פתרון תא 20 μl. החלקיקים שטופלו BSA הזהב אינם מגיבים עם תאים, אבל הם יהיה צורך כסמנים fiducial לשיקום של tomograms.
  4. החלה 4 μl של התא פתרון תערובת זהב זוהר המשוחרר רשת א.מ. ב Vitrobot ב 100% לחות. הרשת היא באופן אוטומטי מחק משני הצדדים עם נייר סינון מס 1. זה מסיר עודפי נוזלים, כך שרק שכבה דקה של תאים התקשורת שלהם נשאר. הרשת הוא צלל אז במהירות לתוך תערובת נוזלית של אתאן פרופן כי הוא מקורר עד 77K בערך עם חנקן נוזלי. במהלך תהליך זה, המדגם הוא קפוא במהירות רבה כל כך את היווצרות של גבישי קרח נמנעת של סרטים דקים <1 מיקרומטר.
  5. מוציאים בזהירות את הרשת מתערובת אתאן / פרופאן ובמהירות להעביר לתוך קופסת אחסון רשת הנשמרת תחת חנקן נוזלי.

ג. לחץ מקפיא cryo גבוהה חתך עבה של תאים

עבור תאים עבה יותר, הקפאת בלחץ גבוה מפחית התגבשות קרח לאחר מכן חתך cryo הופך רזה מספיק דגימות עבור הדמיה EM. 5, 6, 7 יש הרבה בעלי הדגימה השונות הזמינות עבור הקפאת בלחץ גבוה, הבחירה שלך תהיה תלויה המדגם, סוג של מכונת הקפאת בשימוש או את היישום תחקיר שנבחר. כאן אנו משתמשים באל HPM-Tec 010 במקפיא בלחץ גבוה cryo אולטרה microtome מודל UC6/FC6 מ Leica Microsystems.

  1. עבור חיידקים, 15mls טווה תרבות OD> 0.5 נלקח ישירות מן 37 ° C החממה centrifuged ב 1000rpm במשך 3 דקות. לאחר הסרת supernatant, 0.5ml תערובת של התרבות גלולה הנותרים עם 0.5ml של cryoprotectant dextran 20% ולאחר מכן צנטריפוגות ב 13000rpm למשך 15 שניות.
  2. לאחר הסרת supernatant, 0.1ml פיפטה של ​​גלולה סופר להדביק קצה חום אטום micropipette אשר כבר מכיל 0.2ml 20% dextran cryoprotecant (40000Mwt). צנטריפוגה את התערובת קצה micropipette בסל"ד 13,000 במשך 30 שניות ולהסיר supernatant. 5-10 גלולה הדוק μl נראה בקצה אטום.
  3. "טפלון" בעל כיפת נחושת מצופה רכוב planchet מוכן הזרוע בלחץ גבוה במקפיא מחזיק מקבל את העיסה חצי כיפה והוא חתום שטוח כובע פליז שותף שלה.
  4. הרכבה הזרוע הוא הכניס מיד למקפיא דרוך בלחץ גבוה מוכן להקפאה.
  5. בלחץ 2100 בר פליז בשילוב planchet יחידה שמכילה את התאים הוא מקורר במהירות של מטוס סילון של חנקן נוזלי בלחץ גבוה, הסרת מכלול הזרוע מיידי צולל לתוך אמבט של חנקן נוזלי המונע planchet מן ההתחממות.
  6. יחידות Planchet מאוחסנים תחת חנקן נוזלי עד הנדרשים cryo-חתך.
  7. כדי לחשוף את הכיפה היטב קפוא של תאים עבור חתך, שני planchets נחושת מופרדים בקפידה under חנקן נוזלי.
  8. כיפת קפוא מושלם של תאים הוא מזוגגות במראה, ללא סדקים ובקיעים נוקלאציה קרח.
  9. Planchet זה מועבר -170 ° C precooled קאמרית רכוב מאובטח על cryo-microtome סגן כמו צ'אק.
  10. Cryomicrotome מקורר מכיל cryotools החיוניות לצורך חתך, אלה כוללים: זווית נמוכה cryo-סכין יהלום, כלי יהלום זמירה, פלטפורמה לעיתונות, תיבת אחסון רשת, יחידת אנטי סטטי ספריי מנגנון הרשת מחזיקה.
  11. עבור סרט מוצלח חתך באזור הכיפה החיצונית בתחילה בצורת מרובע <0.2mm ידי כלי יהלום זמירה ומהירות חתך מהיר תוך שמירה על עומק ~ 200μm של המערכת קפוא היטב.
  12. עם תרסיס antistatic מכוון הסכין בזווית נמוכה ותמיכה ברשתות נחושת בסמיכות, סכין יהלום מתקדמים בזהירות כדי לחסום בפני מלוטש הכין עבור חתך.
  13. Microtome פרמטרים נבחרים, כגון הגדרת סעיף עובי בין 50-350 ננומטר, יחד עם מהירות חיתוך של ~ 0.4mm/sec חלון חיתוך צרים. חשוב לשלוט על טווח עוצמת תרסיס antistatic ו לתנאי לחות נמוכה בסביבה הקרובה.
  14. כמו בסעיפים הראשונים שיוצרו המוליך עפעף בסדר הוא תמרן ביד או micromanipulator כדי לתפוס את הסעיפים הראשונים מחליק את זווית נמוכה יהלום בקצה הסכין.
  15. בעוד סרט סעיפים נאלץ את הסכין, הם נתמכים על ידי בדיקה בעדינות עפעף והוביל לאורך תמיכה הנחושת רשת בקרבת מקום.
  16. כדי לתקוע את החלקים, הרשת עמוסה בסרטים אז היא לחצה בחוזקה באמצעות בדיקה מקורר מלוטשים, כסף, חלקים מסוימים הם כל כך טעון המכשירים antistatic האחרונה עשויה לסייע בתהליך ההדבקה.
  17. תיבות רשת נשמרים לצורך אחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי מקורר השולח יבש עד המיקרוסקופ מוכן להעביר לרשת.

IV. בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור cryo

תאים חיידקיים על הרשת ניתן הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור cryo (cryoLM). המיקרוסקופ אנו משתמשים כאן הוא מיקרוסקופ אישית Nikon הפוך טי E / B עם המרחק הנוסף עבודה ארוך (ELWD) המטרה 60x עדשה האוויר. רשתות נשמרים בשלב cryo במהלך הדמיה, שהינה פיי שונה בשלב cryo עבור מיקרוסקופ אור. באמצעות רשת מוצא, התאים יכולים להיות ממוקם על הריבועים רשת ותמונות cryoLM להיות מתואמים עם tomograms cryoEM.

  1. טען רשתות לתוך מחסניות על cryo-התחנה. מחסניות הם מנהג שונה מכל מחסנית סטנדרטית EM שלנו עבור פיי TF30H-polara. רשת נערכת על ידי טבעות קליפ נחושת. מחסנית נשמרת אז צינורית להעברת חנקן נוזלי.
  2. מצננים את הבמה cryo לטמפרטורת חנקן נוזלי (-190 ° C).
  3. טען את המחסנית לשלב cryo ולהעביר את הרשת לתוך חלון הצפייה. השלב יכול להכיל עד שתי מחסניות שונה המותאם אישית.
  4. מנמיכים את העדשה הקבל מוקד העדשה אובייקטיבי 60x על רשת.
  5. מצא את התאים לקחת תמונות. עבור LM בקורלציה וללמוד EM, לרשת נסרק סביב האזור של התאים, לאיתור תאים בהמשך EM.
  6. לאחר הדמיה הרשת, לשים את המחסנית בחזרה לתוך הצינור ולשמור את הצינורית חנקן נוזלי עד מוכן להיות צילמו ב EM.

V. איסוף סדרה הטיה של TEM cryo

כדי לקבל tomogram 3D של תא החיידק, סדרה של תמונות הקרנת נלקחים בעוד מדגם מוטה באופן הדרגתי לאורך אחד או שני צירים של TEM cryo. בהתחשב זוויות הטיה והגדרות ניסיוניות אחרות, יש תוכנות שונות זמין באופן אוטומטי לאסוף את סדרת להטות. אנו משתמשים Leginon עבור TEM שלנו cryo אשר פיי TF30H-polara. היא מאפשרת באופן אוטומטי לקחת סדרה הטיה של תאים שנבחרו מראש. 8

  1. טען את המחסניות לתוך מחזיק רב הבחירה (MSH) בתחנת cryo precooled. MSH יכול להכיל עד 6 מחסניות.
  2. חבר את MSH את TF30H-polara, לבחור אחד מחסנית ו להכניס אותו לתוך הטור EM.
  3. התחל Leginon לקוח על המחשב EM תוכנית Leginon הראשי על העבודה האחרת.
  4. הגדרת presets (תנאים תמונה) לישיבה Leginon. הפרמטרים החשובים הם את ההגדלה, את הערך תחת להתמקד, המינון אלקטרונים זוויות הטיה לסדרת להטות, כולל זווית ההתחלה, זווית קצה במרווחים.
  5. בחירת מטרות על תמונות החל ההגדלה הנמוכה ביותר ולשלוח אותם לשלב הבא עם הגדלה גבוהה.
  6. תור את כל יעדי איסוף להטות סדרת ולהגיש את כל אותם צעד "טומוגרפיה" הסופי.
  7. תהליך איסוף הנתונים, ניתן לנטר באמצעות כלי אינטרנט מכל תחנת עבודה מקומית.
  8. לאחר איסוף נתוני הניסוי נעשה, מטהלטעון את השלמת להטות סדרה על תחנת עבודה מקומית לשיקום.

VI. Biosafety שיקולים

רוב דגימות ביולוגיות שאנחנו עובדים איתם הם פתוגניים שאינם ואת כבר מבודד מהאדמה, מי ברז או המעיים של חרקים. הטכניקה aseptic יסוד מספיק לטיפול דגימות אלה. עבודה עם פתוגנים דורש את ביצוע הצעדים בטיחות נוספים, אולם עבור סיכונים קיצוניים, מעבדות כמה התקינו כולו cryo-EM מיקרוסקופים בתוך BSL-3 מעבדות. להלן חלק מהדרכים צמצמנו את הסיכון של עבודה עם פתוגנים במעבדה שלנו.

  1. Pathogenicity של מדגם יכול להיות נחלש או כימית או גנטית. מעבדות רבות עושה cryo-EM של וירוסים יש מומת להם fixatives כימיים לפני הקפאת-לצלול. כחלופה, מוטציות מפתח יכול להיות הציג להבהיר כי דגימות זיהומיות שאינם, כולל למשל inactivating מוטציות נקודה אנזימים מסוימים או לדפוק את הקולטנים.
  2. ציוד מגן אישי כגון כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן יש ללבוש.
  3. דגימות מסוכנים יכולים להיות מטופלים בתוך ארון biosafety (BSC). תרבויות חיידקיים יכולים להיות מבוגר, מרוכז, ואפילו לצלול קפוא על EM רשתות של BSC. יש לנו יותר, מכשיר ידני לצלול מקפיא שמתאים BSC שלנו למטרה זו. אם עקביות רבה יותר המוצעים על ידי-מקפיאים לצלול אוטומטית יש צורך, הם יכולים להיות מוחדר BSC, או, יותר פשוט, במקרים מסוימים יש לנו תמך רפידות סופג של Vitrobot שלנו עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע זיהום של המכשיר. כאשר עובדים עם BSC, כמו רבים של כלים וחומרים ככל האפשר להיכנס או לצאת בארון יש לחטא עם אתנול 70%. בעת הכנת רשתות שלנו, אנו משתמשים בנפחים קטנים של תרבות חיידקי או ויראלי (בדרך כלל 4 אול), שרובם מקבל מחק ידי העיתון Whatman. הנייר סופג, טיפים פיפטה, תרבות הנותרים הם נפטרים כמו פסולת ביולוגית מסוכנת. כל הכלים והמשטחים חשופים הם וחיטוי עם אקונומיקה מדוללת, אתנול 95% ולאחר מכן מים.
  4. ברגע רשתות קפואים, הם נשמרים בטמפרטורות חנקן נוזלי בכל אוסף אחסון נתונים. הוכח כי התאים יכולים לשרוד הקפאה ואז מפשיר, לכן אנו ממשיכים להתייחס אליהם כאל מסוכנים בכל אוסף אחסון נתונים. בסופו של איסוף נתונים, מחסניות המכילות רשתות קפוא יוסרו מן cryo-TEM והפיל ישירות אלכוהול 70%. אמנם נדיר, יש לציין שלפעמים רשתות הם "ירדו" בתוך העמודה, ואת ההשלכות של אירוע כזה אמור להיות שקל עבור כל דגימה מסוכנים. רוב של המיקרוסקופ היא בטמפרטורת החדר, ולכן המדגם על רשת ירד עלול להפשיר בתוך הטור ולהפוך מיובש לחלוטין בריק גבוהה במיוחד של EM. זה היה ברור להשבית כמה דגימות ביולוגיות, אבל אולי לא וירוסים חזקים, ואת שרידי מיובש המדגם עלול להשתחרר כמו אירוסולים כאשר העמודה מיקרוסקופ נפתח הבא עבור השירות.

VII. Tomogram לשיקום

Tomograms של תאים חיידקיים הם שוחזרו באמצעות תוכנה. ישנן מספר תוכנות עבור עבודה זו. אנו משתמשים Raptor לשיקום אוטומטית tomograms ההקרנה. 9 כפי להטות אוטומטיות סדרת יישור ושיקום לאחר מכן היא משימה לא טריוויאלית, Raptor כרגע אין שיעור הצלחה של 100%. במקרה של כישלון Raptor או את הצורך בשחזור באיכות גבוהה, אנו משתמשים יישור התמונה ידנית ושיקום עם eTomo בסוויטה טומוגרפיה IMOD תוכנה. 10, 11

  1. הורדה כל הסדרה להטות הפרט משרת האינטרנט Leginon המקומית. שמור אותם בספרייה שבה הם יכולים בקלות להיות ממוקם.
  2. ידנית לבדוק את סדרת להטות באמצעות הצופה 3dmod של IMOD וזורקים אותם כאשר Leginon נכשלה מעקב היעד או לייצר סדרה להטות שימושי.
  3. אנחנו רצים Raptor מופץ על מכונות לינוקס במעבדה באמצעות אפרסק (מערכת פרל מבוססי להפיץ משימות ברשת). אנו לציין את הגודל של סמנים fiducial שלנו, כלומר חלקיקי זהב colloidal, מספר סמנים לשמש לשיקום, פיקסל בגודל, בעובי הרצוי של שיקום, הגורם binning ועוד מספר הגדרות בסיסיות (כגון קלט, נתיבי פלט בפורמט הפלט) בשורת הפקודה ולהשאיר אותו לרוץ, בדרך כלל 20min ל 2h עבור במערך 122-התמונה (2k על ידי 2k). אם מרוצה מכך שיקום, השלבים להלן בסעיף זה ניתן לדלג.
  4. כאשר נדרש שחזור ידני, לשנות קבצים ". MRC" ל "רחוב". לטעון סדרה להטות הפרט לתוך ה-GUI eTomo בסוויטה טומוגרפיה IMOD.
  5. ציין סדרה להטות ציר סוג (צירים יחיד או כפול), והזן את גודל fiducial בשימוש sample הכנה. סרוק את כותרת הקובץ כדי לקבוע גודל פיקסל, והמשך על ידי לחיצה על "צור סקריפטים Com".
  6. בצע את השלבים של כרטיסיה ב GUI eTomo לשחזר את tomogram מהסדרה להטות. בדוק ואמת את התוצאה לאחר כל שלב, ואם לא מרוצים, תמיד נוכל לחזור צעד כל הקודם לעבד מחדש משם. "טרום עיבוד" הוא לבצע עיבוד הכנה ולהסיר באופן חריג בעוצמה גבוהה פיקסלים נגרמת על ידי קרני ה-X. "יישור גס" מייצרת סדרה להטות שבו כל תמונה הקרנה הבאים בסדרה להטות מיושר הקודמת על ידי מתאם צולבת. אנו מגדירים אשר חרוזי זהב שישמש fiducials ב "דור דגם Fiducial", והתוכנית המסילה סמנים fiducial בתמונה כל השלכה ובונה "יישור פיין". "המיקום Tomogram" מאפשר חיתוך tomogram ב Z. "סטאק מזדהות הסופי" מופק באמצעות אינטרפולציה ליניארית, פונקציות כגון תיקון-CTF, זהב מחק ו-2D סינון יכול להיות מיושם אופציונלי. Tomogram מחושבת "צור Tomogram" על ידי הקרנת בחזרה משוקלל במרחב פורייה. "לאחר עיבוד" מאפשר חיתוך של tomogram לאזור-XY ריבית ומדרוג הניגוד בטווח של מבנים של עניין, "Clean Up" מוחקת את כל קבצי ביניים משחררת את שטח הדיסק.

VIII. אחסון של Tomograms במאגר

אנו משתמשים מבוססי אינטרנט בתוך הבית באתר לארגן, לאחסן, לחפש ולהפיץ את הנתונים טומוגרפית. עבור כל סדרה להטות, אנחנו יכולים להקליט פרטים המדגם, אוסף פרמטרים מיקרוסקופ, סדרה להטות גלם, כמו גם קשור שחזור 3D ו עיבוד קבצים אחרים. הדף הראשי גלישה מציג תמונה ממוזערת וכן בהשתתפות "YouTube" כמו בסרט tomogram עבור כל אחד, את הערכים יכול להיות מאורגן על ידי תדירות להוריד, סוג הדגימה היוצר, או תאריך. משתמשים יכולים לחפש במאגר על ידי הזנת מילות מפתח או תכונות מיוחדות. כיום יותר מ 4500 סדרת טומוגרפית להטות הופקדו באתר, המכסים כמעט 60 סוגים של מינים / דגימה, עם סך של יותר מ 11,000 הקבצים הקשורים.

IX. ניתוח פילוח Tomograms

  1. הפרטים המבניים של tomograms ניתן לראות ונותחו באמצעות תוכנת שונה עם עיבוד תמונה כלים, הצופה למשל 3dmod של IMOD עם ZAP, XYZ חלון כלי פריסה.
  2. השלב הבא הוא ליצור פילוח של התמונה 3D (tomogram). פילוח מקצה אחד voxel (פיקסל נפחי) של התמונה 3D תווית המתארת ​​את האזור או חומר אשר voxel שייכת, למשל, קרום או cytoskeleton. אנו משתמשים בכלי תוכנה כגון 3dmod ב IMOD ואמירה (הדמיה הפרצוף).
  3. למרות שחלק כלי תוכנה לספק מודולים פילוח אוטומטי (למשל, פילוח הסף), לעתים קרובות הם עובדים רק עבור תמונות עם ניגודיות גבוהה. תמונות 3D נגזר cryotomography במינון נמוך אלקטרונים יש ניגודיות נמוכה כגון כי ברוב המקרים אנחנו צריכים להקצות באופן ידני תווית voxel כל אחד.
  4. פילוח מאוחסן בקובץ נתונים נפרד. זה יכול לשמש כדי ליצור מודל השטח שבו כל אזור מוצגת עם צבע שונים שנצפו ב-3D.
  5. Tomograms ניתן להשתמש לצורך ניתוח אחרים. לדוגמה, התאמת התבנית החישוב הבאים יכולה להניב מידע סטטיסטי של המתחם macromolecular כגון ריבוזומים. יישור Subvolume ו בממוצע מראה המבנים ניגודיות גבוהה יותר מגלה פרטים עדינה.

X. יצירת סרטים המבוססים על tomograms

אנחנו עושים סרטים לסכם כל הפרויקט לתת סיור ויזואלי של תמונות טומוגרפית שלנו.

  1. בצע סקריפט של תכונות בנתונים ברצוננו להראות כיצד להפוך תכונות אלה. לדוגמה, סרט טיפוסי של הפרויקט כולו תא טומוגרפיה, אנחנו מתחילים ידי הצגת סדרת נתונים נציג להטות ולאחר מכן בצע עם נוף פרוסה אחר פרוסה של tomogram המשוחזר. בשלב הבא, אנו מציגים פילוח של מקרומולקולות מפתח בתא, למשל, מנוע flagellar או מורכבת chemoreceptor או נימה cytosolic. לבסוף, אנו מסיקים עם מודל המציג פרשנות אידיאליזציה של מקרומולקולות אנחנו לומדים.
  2. תוכנת גרפיקה ייצוג כגון עמירה או כימרה משמשים כדי להבהיר את המסגרות עדיין בודדים של הסרט. אנחנו בדרך כלל להרכיב סרטים מ קליפים קצרים כדי להקל על שינויים לכל קליפ.
  3. השתמש בתוכנות עריכת סרט מסחרי כגון Adobe Premiere להרכיב את מסגרות עדיין לתוך קטעי סרט, ולאחר מכן את הסרטונים סרט לסרט הסופי.
  4. התחלנו להוסיף אודיו במסלול כי מספרת את הסרט. קריינות משמש "אגדה הסרט" ומאפשר לקהל להתמקד בנתונים שהוצגו תוך כדי צפייה בסרט.

XI. הנפשה

חזותיסיפורים מתקשר ידע ללא צורך את אוצר המילים מורכבות של תחומים מדעיים ספציפיים. מושגים קשים להיות פשוטה כאשר בליווי הדגמה חזותית. המנהג של הממחישות רעיונות ביולוגיים עם קריקטורות אינו חדש. עם זאת, רק בעשור האחרון יש כלים מתוחכמים של יצירת תוכן 3D מקצועי הובאו לשאת על עצמו את המשימה של בניית אנימציות מדעית. כיום יש עשרות חוקרים פעיל בתרגום מערכות ביולוגיות לתוך 3D אנימציות דינמי. אנימציות יפות רבות מוצגות על http://MolecularMovies.org . אתר זה מארח גם הדרכות ומפיצה ערכת כלים חינם עבור מניפולציה מבנים מולקולריים ב autodesk MAYA. מקור פתוח 3D חבילת תוכן, בלנדר, מכיל כמה גולשים יבואנים PDB.

תהליך יצירת אנימציה 3D בדרך כלל כרוכה בשלושה שלבים:

  1. דוגמנות: אנו משתמשים בתוכנות גרפיקה ייצוג לייצא משטחי לתוך פורמטים שיכול להיות מיובאים לתוך MAYA. משטחים אלה הם גם segmentations מ tomograms משוחזר, למשל, קרומים, גרגרי, או חוטים, או ייצוגים של משטחים מולקולרית. Segmentations Tomogram מבוצעות עמירה, משטחים מולקולרית נוצרות כימרה או VMD. ייצוגים אטומית של מולקולות ניתן לייבא ישירות לתוך מאיה מקבצים PDB. לאחר המודלים בתוך מאיה, הם עשויים להיות שונה, לשכפל, ואת מיקומו על פי הצורך.
  2. Animating: אנימציות בנויים באופן מסורתי על ידי יד, עם האמן ידני העברת אובייקטים נעים הקלטה סדרה של מסגרות מפתח. ההתקדמות חדש בתוכנת גרפיקה 3D עכשיו לאפשר דינמיקה להיות שנוצר procedurally, דרך מובנית מודולים scripting APIs.
  3. עיבוד: דינמיקה פרוצדורלי יכול לספק אנימציות משכנע דינמי של תהליכים ביולוגיים, כגון מבני הרכבה עצמית. עם זאת, בשל הקושי של הדמיה מציאותית מערכות ביולוגיות, רוב 3D אנימציות בנויים עדיין משתמש בטכניקות מסורתיות מסגרת מפתח. לאחר דינמיקה הם בסדר, ביאורים חזותיים, מרקמים אפקטים של תאורה ניתן להוסיף. לבסוף, דרך המצלמה נבחר את האנימציה סיימו מעובד לסרט.

Discussion

אנו מציגים במאמר זה וידאו איך לעשות ECT של תאים חיידקיים. מוגבלת על ידי מרחב וזמן, אנחנו רק להראות את פרוטוקול כללי. פרטים נוספים ניתן למצוא מאמרים, מידע מקוון או אחרים הניתנים על ידי מייצרת הציוד ומפתחי תוכנה, מקבוצות מחקר ECT. בהתאם מינים שונים חיידקי למד, הציוד המשמש לבין האינטרס מבניים בתאים, את הפרוטוקול ואת הפרמטרים ניסיוני צריכים להיבדק אופטימיזציה.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AI067548 R01, R01 GM081520, GM086200 R01, R01 AI049194 ו P01 GM066521 כדי GJJ כמו גם את הווארד יוז רפואי במכון, במכון Beckman בקלטק, מתנות קלטק מן גורדון ובטי מור קרן Agouron המכון. MSL נתמך על ידי מענק 2R37-NIH A1041239-06A1 על פמלה ס ביורקמן. לייקה מיקרוסיסטמס חביב בתנאי תוכן וידאו של אוסף cryosection. תוצאות נציג Treponema primitia נאספו ועובדו על גאווין א מרפי, ופורסם למיקרוביולוגיה מולקולרית עם הכותרת "ultrastructures רומן של Treponema primitia והשלכותיהם על תנועתיות". (מרפי, G. et al. מול. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 0.1% solution
MKIII Vitrobot FEI
Gold colloid solution Sigma-Aldrich G1527-25ml 10 nm
Bovine serum Albumin Invitrogen P2489 10%
Nr 1 Filter paper Whatman, GE Healthcare 1001 055
Dextran Sigma-Aldrich 31389 15-25%, MW 39000
Brass-domed planchet Swiss Precision Company
Bal-Tec HPm 010 high pressure freezer Leica Microsystems
Cryo-ultra microtome UC6/FC6 Leica Microsystems
Diamond cryo trim 45 Diatome
Static line II ioniser Diatome
CX100 Dry shipper Taylor-Wharton
MSH loading station Gatan
Ti E/B inverted microscope Nikon Instruments Custom
Cryo LM stage FEI Custom
TF30-polara FEI With UltraCam from Gatan
Amira Visage Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  2. Li, Z., Jensen, G. J. Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure. Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).
  3. Frank, J. Three-dimensional imaging of biological complexity. J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).
  4. Iancu, C. V. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285-294 (2001).
  6. Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator. J. Microsc. 224, 129-134 (2006).
  7. Pierson, J. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. J. Struct. Biol. 169, (2009).
  8. Suloway, C. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).
  9. Fernando, A. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
  10. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  11. Mastronarde, D. N. Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution. J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).
אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., McDowall, A., Dobro, M. J., Briegel, A., Ladinsky, M., Shi, J., Tocheva, E. I., Beeby, M., Pilhofer, M., Ding, H. J., Li, Z., Gan, L., Morris, D. M., Jensen, G. J. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943, doi:10.3791/1943 (2010).More

Chen, S., McDowall, A., Dobro, M. J., Briegel, A., Ladinsky, M., Shi, J., Tocheva, E. I., Beeby, M., Pilhofer, M., Ding, H. J., Li, Z., Gan, L., Morris, D. M., Jensen, G. J. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943, doi:10.3791/1943 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter