وقد أثبتت الطيف الكتلي ليكون أداة قيمة لتحليل البروتين المجمعات الكبيرة. هذا الأسلوب يتيح نظرة ثاقبة لتكوين العمارة ، رياضيات الكيمياء والشاملة متعددة الوحيدات التجمعات. هنا ، وصفنا ، وخطوة بخطوة ، وكيفية إجراء تحليل الطيف الكتلي الهيكلي ، وتوصيف البنى الجزيئات.
الخلايا الحية مراقبة وتنظيم العمليات البيولوجية من خلال العمل المنسق لعدد كبير من البروتينات لتجميع أنفسهم في صفيف الحيوية مجمعات متعددة البروتين ، 1. للحصول على فهم العمليات الميكانيكية الخلوية المختلفة ، لا بد من تحديد بنية البروتين مثل هذه المجمعات ، وتكشف عن كيفية تنظيمها الهيكلي يملي وظيفتها. كثير من جوانب متعددة البروتين المجمعات ، على أية حال ، من الصعب تميز ، نظرا لطبيعتها غير المتجانسة ، والهيكل غير المتماثلة ، وديناميكية. لذا ، ثمة حاجة إلى نهج جديد لدراسة مستويات عال من التنظيم البروتين.
واحدة من أدوات البيولوجيا الهيكلية الناشئة عن تحليل الجزيئات المجمعات هو الطيف الكتلي (MS) 2-5. هذا الأسلوب يعطي معلومات عن تكوين البروتينات المعقدة ، رياضيات الكيمياء الوحيدات ، والبنية الهيكلية. قوة MS مستمد من حساسية عالية ، ونتيجة لذلك ، شرط العينة المنخفضة ، والتي تمكن من فحص البروتين المجمعات التي أعرب عنها في المستويات المحلية. ميزة أخرى هي سرعة التحليل ، والذي يسمح برصد ردود الفعل في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك ، يمكن للتقنية قياس الوقت نفسه خصائص السكان منفصلة تتعايش في خليط.
هنا ، نحن تصف بروتوكول مفصلة لتطبيق MS الهيكلي لتحليل البروتين التجمعات الكبيرة. الإجراء يبدأ التحضير من الذهب المطلي الشعيرات الدموية لالتأين electrospray nanoflow (نيسي). ثم واصلت مع إعداد العينات ، والتأكيد على الشروط التي ينبغي أن تكون عازلة متوافق مع نيسي من جهة ، وتمكين للحفاظ على المجمعات سليمة من ناحية أخرى. نفسر ذلك الحين ، خطوة بخطوة ، وكيفية تحسين ظروف تجريبية لقياس كتلة عالية والحصول على الماجستير وجنبا إلى جنب أطياف MS. وأخيرا ، فإننا نرسم معالجة البيانات والتحليلات التي تتبع. بدلا من محاولة كل جانب من جوانب تميز المجالس البروتين ، ويدخل هذا البروتوكول الإجراءات الأساسية MS ، مما يتيح أداء التجارب MS و MS / MS على غير التساهمية المجمعات. عموما ، فإن هدفنا هو تزويد الباحثين غير ملم مع MS مجال الهيكلية ، مع العلم التجريبي من الأدوات الرئيسية.
وينبغي أن تعطى للحصول على الأطياف عالية الجودة الاهتمام للخطوات إعداد العينات ، والتي تتضمن تركيز العينة وتبادل العازلة. وسوف أكثر من عينات العائد المخفف اشارة منخفضة ، في حين عينات عالية التركيز ويمكن لزجة نوعا ما ، وكتلة الإبرة electrospray. وعلاوة على ذلك ، والمضافات حل مثل الأملاح ، والجلسرين والمنظفات الصناعية وايونات المعادن ، والحد من وكلاء (DTT أو β المركابتويثانول) ، وتميل إلى الانضمام إلى السطح الخارجي للبروتينات ، وتتسبب في توسيع نطاق القمم. ولذلك ، من أجل تحقيق حل جيدا قمم ، ينبغي أن تضاف هذه المكونات عند أدنى تركيز ممكن.
معلمة أخرى المفتاح هو موقف nanoflow الشعرية ، نسبة إلى فوهة مطياف الكتلة. قد العثور على "بقعة الحلو" يمكن أن يكون تحديا للمستخدمين عديمي الخبرة ، ومع ذلك ، فإنه يؤثر بشكل كبير على نوعية الأطياف. من المهم أيضا النظر في nanoflow الشعرية قبل الشروع في الرش. حجم القطيرات هي وظيفة من قطر الحافة ، التي ينبغي أن تكون 1μm ~. قطرات صغيرة تؤدي إلى تأين أكثر كفاءة ، وبالتالي سيكون من المفيد. من المهم أيضا للتحقق من عدم وجود فقاعات هواء داخل الشعيرات الدموية التي يمكن ان تمنع تدفق ، والتي لم يتم تجريد طلاء الذهب من خلال اقتناء الشعرية ، وإذا كان الأمر كذلك ، خفض المزيد من الحافة. نضع في اعتبارنا أن كمية زائدة من عينة سيزيد من امكانية تحسين ظروف MS مثل الجهد الشعري ، الفولتية تسريع والضغط والطاقة الاصطدام.
عموما ، لقد تم استخدام الإجراءات التي شرحها في بروتوكول لتحديد التركيب ، رياضيات الكيمياء والهندسة المعمارية من البروتين العديد من المجمعات (انظر استعراض 2،3،4). تحليل المجمعات الكبيرة مثل نجمة داود الحمراء في 19 الريبوسوم وcapsids الفيروس أمر غاية 20-22 ، في تحديد ملزم لالركيزة آلات جزيئية 23-25 ، أو توصيف شبكات التفاعل الوحيدات بمثابة 26،17،16،17،27،28 لكن بضعة أمثلة من قيمة هذا النهج.
The authors have nothing to disclose.
المؤلفان بالشكر إلى أعضاء الفريق لاستعراضها شارون حرجة ، ومساهماتها في المخطوطة. ونحن ممتنون للدعم البرامج وموراشا Bikura ، علم إسرائيل مؤسسة (المنحة رقم 378/08 و1823-1807) ، وجوزيف كوهن مينيرفا مركز للبحوث غشاء حيوي ، وبرنامج الأسرة Chais زملاء للعلماء الجديد ، إبراهيم وسونيا Rochlin المؤسسة ؛ تراست الخيرية الأسرة وولفسون ، وهيلين وميلتون ألف مركز للهيكل Kimmelman الجزيئية البيولوجية والجمعية ، وتركة شلومو وBeirzwinsky سابين ؛ Meil دي بوتون Aynsley ، وكارين سيم ، المملكة المتحدة. ونحن ممتنون للتوفيق ودان Yadid ايتمار على إعطائنا عينة lectin البديل.
Sample requirements:
Sample | Requirement | Comments |
Volume | 1-2 μL | Per capillary |
Concentration | 1-20μM | Per complex |
Buffer | Aquanos volatile buffer such as ammonium acetate at pH= 6- 8 | Typically 5 mM-1M |
Detergent | Minimal | Clusters of detergent molecules produce broad and unresolved peaks |
Glycerol | Minimal (up to 5%) | Adheres nonspecifically to proteins and, consequently, broad peaks are observed |
Organic solvents | Up to 50% | Might denature proteins complexes |
Acids | Up to 4% | Denature protein complexes |
Salts | Minimal | Salt adducts lead to broad and unresolved peaks |
DTT | Minimal | 1-2 μM can be present |
Chelating agents | Minimal | Above 250 μM lead to extensive adduct formation |