质谱法已被证明是一个有价值的工具,用于分析大型蛋白质复合物的。这种方法使多亚基组件组成,化学计量学和整体结构的见解。在这里,我们所描述的,一步一步,如何执行一个结构性的质谱分析,和特性的大分子结构。
活细胞控制和调节生物过程,采取协调一致的行动,通过大量的蛋白质,自己组装成一个阵列的动态,多蛋白质复合物 1 。为了获得各种细胞过程的机械理解,它是至关重要的,以确定这种蛋白复合物的结构,并揭示其组织结构如何决定其功能。多蛋白质复合物的许多方面,但是,难的特点,由于其异质性,非对称结构和动态。因此,新的方法所需的蛋白质组织的三级研究。
新兴的分析大分子复合物的结构生物学工具之一,是质谱(MS)2-5 。这种方法产生复杂的蛋白质组成,亚基的化学计量,和结构拓扑信息。 MS的权力来自其高灵敏度,作为一个结果,样品要求低,从而使内源性水平表达的蛋白质复合物的检查。另一个优点是分析速度,它允许实时反应监测。此外,该技术可以同时测量的特点共存的混合物中单独的人群。
在这里,我们描述了一个详细的协议结构MS分析大蛋白组件的应用程序。程序开始与纳流电喷雾电离(nESI)准备金涂层毛细管。然后,它继续与样品制备,强调一方面应与nESI兼容,并能保持复合物上的其他完好的缓冲液条件。然后,我们解释,一步一步,如何优化高质量测量的实验条件,并获得MS串联质谱图。最后,我们图表中的数据处理和分析,遵循的。而不是试图来描述蛋白质装配的每一个方面,这个协议是介绍了基本的MS程序,使非共价复合物的MS和MS / MS实验的表现。总的来说,我们的目标是提供的主要实验工具的知识,不了解结构MS领域的研究人员。
为了获得高品质的光谱应注意的样品制备步骤,其中包括样品的浓度和缓冲交换。稀释的样本,将产生一个低信号,而高度浓缩的样品可以而粘稠,并阻止电针。此外,解决方案,如盐,甘油,洗涤剂,金属离子和还原剂(DTT或β-巯基乙醇)添加剂,往往坚持的外表面的蛋白质,并导致扩大峰。因此,为了实现良好的解决峰,这些组件应在尽可能低的浓度增加。
另一个关键参数是纳升级毛细管的位置,相对质谱仪口。寻找“甜蜜点”可能是对没有经验的用户具有挑战性的,不过,它显着影响光谱的质量。同样重要的是检查纳流毛细管前开始喷。墨滴的大小是一个尖端直径,这应该是〜1μm的的功能。小水滴会导致更有效的电离,因此将是有利的。验证,毛细血管内有没有气泡,可以阻止流动同样重要的是,和黄金涂层不剥离从收购过程中的毛细血管;若有,进一步修剪技巧。请记住,一个样品过量会增加优化MS条件,如毛细管电压,加速电压,压力,碰撞能量的可能性。
总体而言,在协议中所解释的程序已被用于确定大量的蛋白质复合物的成分,化学计量学和结构(见评论2,3,4)。 MDA的大型复合物, 如核糖体的19 高度有序的病毒衣壳20-22,分析,确定底物结合的分子机器23-25 日, 或亚基相互作用网络的特性26,17,16,17,27,28作为但这种方法的价值的几个例子。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢他们的严格审查,并为他们贡献的手稿沙龙组的成员。我们Morasha和Bikura方案,以色列科学基金会(批准号:1823至1807年和378/08),约瑟夫科恩密涅瓦生物膜研究中心,翟氏父子家庭研究员新科学家计划,亚伯拉罕的支持表示感谢索尼娅Rochlin基金会,欧胜家庭慈善信托基金的海伦和米尔顿答Kimmelman中心生物分子结构及组装;什洛莫和萨宾Beirzwinsky房地产; Meil德波顿Aynsley,和Karen暹粒,英国。我们非常感谢给我们的凝集素变种样本丹陶菲克和伊塔马尔Yadid。
Sample requirements:
Sample | Requirement | Comments |
Volume | 1-2 μL | Per capillary |
Concentration | 1-20μM | Per complex |
Buffer | Aquanos volatile buffer such as ammonium acetate at pH= 6- 8 | Typically 5 mM-1M |
Detergent | Minimal | Clusters of detergent molecules produce broad and unresolved peaks |
Glycerol | Minimal (up to 5%) | Adheres nonspecifically to proteins and, consequently, broad peaks are observed |
Organic solvents | Up to 50% | Might denature proteins complexes |
Acids | Up to 4% | Denature protein complexes |
Salts | Minimal | Salt adducts lead to broad and unresolved peaks |
DTT | Minimal | 1-2 μM can be present |
Chelating agents | Minimal | Above 250 μM lead to extensive adduct formation |