ट्यूमर के विकास और उपचार के लिए प्रतिक्रिया के बाद bioluminescence इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग कर के साथ intracranial ब्रेन ट्यूमर xenografts की स्थापना

Summary

Luciferase संशोधित मानव मस्तिष्क ट्यूमर xenografts athymic चूहों में intracranially स्थापित कर सकते हैं ट्यूमर के विकास और bioluminescence इमेजिंग का उपयोग कर उपचार के लिए प्रतिक्रिया के बाद निगरानी के साथ. अस्तित्व विश्लेषण के साथ संयोजन में, bioluminescence निगरानी मस्तिष्क ट्यूमर के इलाज के लिए विचार किया जा रहा है चिकित्सा के पूर्व नैदानिक ​​परीक्षण के लिए एक आवश्यक अनुसंधान उपकरण है.

Abstract

ट्रांसप्लांटेशन मॉडल का उपयोग मानव मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं न्यूरो ऑन्कोलॉजी अनुसंधान में कई वर्षों के लिए एक आवश्यक कार्य सेवा की है. अतीत में, मानव ट्यूमर xenograft स्थापना के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रक्रिया संस्कृति बोतल से कोशिकाओं के संग्रह, उपचर्म इंजेक्शन के immunocompromised चूहों में एकत्र कोशिकाओं द्वारा पीछा शामिल. जबकि इस दृष्टिकोण अभी भी कई प्रयोगशालाओं में अक्सर उपयोग देखता है, वहाँ orthotopic xenograft स्थापना की दिशा में पिछले एक दशक से अधिक जोर देने में महत्वपूर्ण बदलाव है, जो मस्तिष्क ट्यूमर के उदाहरण में, उपयुक्त neuroanatomical संरचनाओं में ट्यूमर सेल इंजेक्शन की आवश्यकता किया गया है. क्योंकि intracranial xenograft स्थापना कैलिपरस का उपयोग orthotopic ब्रेन ट्यूमर xenograft मॉडल की दिशा में जोर में बदलाव से प्रत्यक्ष माप के माध्यम से ट्यूमर के विकास, जैसे की निगरानी करने की क्षमता समाप्त मेजबान पशुओं में ट्यूमर बोझ का आकलन करने के लिए गैर इनवेसिव इमेजिंग का उपयोग जरूरी है. वर्तमान में उपलब्ध इमेजिंग तरीकों, bioluminescence निगरानी आमतौर पर संवेदनशीलता, अवसरवादिता, और लागत का सबसे अच्छा संयोजन की पेशकश करने के लिए माना जाता है. यहाँ, हम orthotopic ब्रेन ट्यूमर की स्थापना के लिए, और जब प्रयोगात्मक उपचारों परीक्षण ट्यूमर के विकास और उपचार के उत्तर की निगरानी के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करेंगे.

Protocol

1. ट्यूमर सेल तैयार करना. मानव मस्तिष्क ट्यूमर xenografts के लिए कक्ष या तो sourced किया जा सकता से ट्यूमर athymic चूहों में चमड़े के नीचे वृद्धि के रूप में, या सेल संस्कृति से प्रचारित. दोनों सेल स्रोतों के उपयोग के नीचे चर्चा की है, सेल आरोपण के लिए एक विधि के प्रदर्शन के साथ. Intracranial डिब्बे के हस्तांतरण के लिए चमड़े के नीचे ट्यूमर से कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, excised पार्श्व ट्यूमर संस्कृति बर्तन में रखा जाता है जहां ऊतक शुरू में एक स्केलपेल और दोहराव के लिए एक सेल कुल 1 निलंबन बनाने pipetting द्वारा तो यंत्रवत् बाधित साथ कीमा बनाया हुआ है. सेल कुल निलंबन तो एक 70 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल intracranial इंजेक्शन के लिए उपयुक्त किसी एकल कक्ष निलंबन का उत्पादन फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया है. सेल निलंबन 4 बजे 10 मिनट के लिए 1000 rpm ° सी, और सीरम स्वतंत्र मीडिया के एक उचित मात्रा में गोली सेल resuspending के लिए एक अंतिम कार्य एकाग्रता (नीचे देखें) प्राप्त करने के पहले से aspirated सतह पर तैरनेवाला पर centrifuged है. स्थापित intracranial आरोपण के लिए सेल लाइनों की तैयारी के लिए, कोशिकाओं trypsinizing monolayers द्वारा harvested रहे हैं, या neurosphere निलंबन संस्कृतियों इकट्ठा करके, तो centrifuging और resuspending के रूप में 2 उपर्युक्त कोशिकाओं. इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या इंजेक्शन के neuroanatomical स्थान पर चर निर्भर है. Supratentorial इंजेक्शन के लिए हम नियमित सीरम मुक्त मीडिया (DMEM) के 3 μL में 3-5 x 10 5 कोशिकाओं इंजेक्षन, जबकि brainstem इंजेक्शन 3, के लिए के रूप में 5 x 10 4 कोशिकाओं के रूप में कुछ 0.5 μL में इंजेक्ट कर रहे हैं. की सिफारिश की तुलना में बड़ी मात्रा में इंजेक्शन सुई तंत्र के माध्यम से ट्यूमर कोशिका भाटा में परिणामी exophytic (चित्रा 1), बजाय intracranial ट्यूमर के विकास के साथ, परिणाम कर सकते हैं. Intracranial इंजेक्शन के लिए नमूना वापस लेने के बाद, शेष सेल निलंबन बर्फ में रखा जाना चाहिए अक्सर उपयुक्त एकाग्रता बनाए रखने जबकि एक इंजेक्शन श्रृंखला के सदस्यों के बीच intracranial ट्यूमर स्थापना पूरा मिश्रित सामग्री के साथ. 2. ट्यूमर सेल आरोपण ध्यान दें, नीचे वर्णित प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और संस्थागत पशु का प्रयोग करें और कैलिफोर्निया के सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय में केयर समिति द्वारा मंजूरी दे दी. शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में एक निस्संक्रामक के साथ सभी सतहों जैसे, 2% chlorhexidine समाधान छिड़काव द्वारा तैयार किया जाना चाहिए. निस्संक्रामक का उपयोग करने के बाद, निम्नलिखित आपूर्ति शल्य चिकित्सा क्षेत्र में रखा जाना चाहिए: ताप के लिए माउस शरीर का तापमान बनाए रखने के पैड दो छोटे पेट्री डिश, एक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड युक्त, और एक 2% chlorhexidine युक्त बाँझ धुंध और कपास swabs बाँझ डिस्पोजेबल नलियां Autoclaved शल्य चिकित्सा ऊन बेचनेवाला संज्ञाहरण के लिए एक इंजेक्शन संवेदनाहारी इस्तेमाल किया जाना चाहिए, आमतौर पर एक मिश्रण ketamine-xylazine. एक बार एक माउस anesthetized है, खोपड़ी बाँझ धुंध का एक टुकड़ा है chlorhexidine समाधान में डूबा हुआ है के साथ कई बार swabbing द्वारा तैयार की है. नेत्र मरहम प्रक्रिया के दौरान पर्याप्त नमी बनाए रखने के लिए लागू किया जाना चाहिए. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग parieto – पश्चकपाल हड्डी पर एक बाण के समान चीरा पूरा, लंबे समय लगभग 1cm. उजागर खोपड़ी की सतह तो एक कपास एक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान में भिगो झाड़ू का उपयोग करते हुए साफ किया जाता है. bregma इस बिंदु पर स्पष्ट हो (वीडियो देखें). ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए निर्देशांक ट्यूमर स्थापना के लिए वांछित साइट के अनुसार अलग अलग होंगे. निम्न कार्यविधि हम intracerebral ट्यूमर स्थापना के लिए एक neuroanatomical स्थान है, जिस पर कई ब्रेन ट्यूमर के रोगियों में ट्यूमर के विकास का अनुभव में 2 का उपयोग करें का प्रतिनिधित्व करता है. ब्रेन ट्यूमर के अनुसंधान में रुचि के अन्य स्थानों PONS brainstem 3 ट्यूमर के शारीरिक मॉडलिंग के लिए, और meningeal ट्यूमर का स्थान 4 मॉडलिंग के लिए अवदृढ़तानिकी इंजेक्शन शामिल हैं. पहले ट्यूमर सेल इंजेक्शन, खोपड़ी पंचर 2 मिमी पर bregma और 1 मिमी राज्याभिषेक सिवनी के लिए पूर्वकाल की सही करने के लिए एक बाँझ 25 गेज तेज सुई, का उपयोग करें जिससे ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन (वीडियो देखें) के लिए एक खोलने बनाने. यह प्रक्रिया दोनों चूहों और चूहों (चूहों के लिए 22 गेज सुई) के लिए अच्छी तरह से काम करता है. पहले सिरिंज में कोशिकाओं ड्राइंग के लिए, अपनी उंगली से दोहन द्वारा सेल निलंबन की सामग्री का मिश्रण. सेल निलंबन के वांछित राशि के साथ सिरिंज लोड, हवाई बुलबुले बनाने से बचने के के लिए सावधान किया जा रहा है. सिरिंज के बाहर तो एक शराब झाड़ू के साथ साफ किया जाना चाहिए करने के लिए किसी भी पक्षपाती कोशिकाओं है, जो extracranial ट्यूमर स्थापना और विकास (चित्रा 1 ए) को रोकने में मदद मिलेगी मुफ्त बाहरी पोंछ. सुनिश्चित करें कि उचित इंजेक्शन गहराई हासिल की है, एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए एक P20 pipetteman टिप के अंत बताया बंद 3mm कटौती. टिप के इस खंड सिरिंज पर फिट किया जा सकता है और इंजेक्शन गहराई की सीमा में कार्य करेगा, और अतिरिक्त यह सुनिश्चित करेंगे कि तीसिरिंज सुई के पी खोपड़ी के नीचे से 3mm है. खोपड़ी सिरिंज सीधा रखें और पहले बनाई गई छेद में, और धीरे धीरे सेल निलंबन (3μL निलंबन एक 1 मिनट की अवधि में इंजेक्शन होना चाहिए) इंजेक्षन. सिरिंज सम्मिलन का एक अनुचित कोण कोशिकाओं और बाद रीढ़ की हड्डी प्रसार (छवि 1B: राइट) के intraventricular इंजेक्शन में परिणाम कर सकते हैं इंजेक्शन पूरा करने पर, एक मिनट के लिए जगह में सुई छोड़, फिर धीरे से वापस लेने (वीडियो देखें): इन चरणों में मदद मिलेगी कम ट्यूमर कोशिका भाटा. बेबस या मुफ्त हाथ intracranial ट्यूमर कोशिका 5 आरोपण करने के लिए दृष्टिकोण करने के लिए एक विकल्प के रूप में एक छोटे जानवर stereotactic फ्रेम (योजनाबद्ध सिंहावलोकन के पैनल एफ), जो आम तौर पर और अधिक सुसंगत इंजेक्शन स्थान को बढ़ावा देता है का उपयोग करें, लेकिन कर सकते हैं की पर्याप्त मात्रा की कीमत पर प्रक्रियात्मक समय. हमारे अनुभव में, दो शल्य चिकित्सा स्टाफ के रूप में कई के रूप में 60 चूहों / घंटा इंजेक्षन मुक्त हाथ दृष्टिकोण का उपयोग करते समय कर सकते हैं, जबकि एक छोटे जानवर stereotactic फ्रेम के साथ अधिक से अधिक इंजेक्शन दर लगभग 15 चूहों / घंटा है. प्रक्रियात्मक अवसरवादिता एक महत्वपूर्ण विचार है जब चूहों की एक बड़ी श्रृंखला इंजेक्शन, और मदद करता है जो समय में ट्यूमर कोशिकाओं, इंजेक्शन जा, बर्फ पर छोड़ दिया जाता है कम. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड और सूखी एक बाँझ सूखी कपास झाड़ू का उपयोग के साथ खोपड़ी को साफ करें. छेद बाँझ हड्डी मोम लागू करें. एक संदंश का प्रयोग, खोपड़ी के साथ खोपड़ी और प्रधान के करीब अधिक आकर्षित. इष्टतम उपचार के लिए, खोपड़ी एक दूसरे के खिलाफ खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष के dermis (नीचे के खिलाफ नीचे) के साथ स्टेपल किया जाना चाहिए. stapled खोपड़ी chlorhexidine समाधान, और buprenorphine तो पोस्ट ऑपरेटिव दर्द से राहत के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रशासित का उपयोग कर साफ किया जाना चाहिए. सभी चूहों के बाद operatively मॉनिटर, जब तक वे इधर – उधर घूमनेवाला हो जाते हैं और सामान्य गतिविधि बनाए रखने. आमतौर पर, वसूली समय के 30 मिनट के आसपास है. 3. ट्यूमर के विकास के bioluminescence निगरानी पृष्ठभूमि. Bioluminescence इमेजिंग (BLI) luciferin के ऑक्सीकरण पर आधारित है [(-) -2 – घ (60-hydroxy-20-benzothiazolyl) thiazone-4 carboxylic एसिड] ऑक्सीजन और adenosine triphosphate (एटीपी) की उपस्थिति में. इस प्रतिक्रिया एंजाइम luciferase है, जो प्रकाश की परिणामी उत्सर्जन photons के साथ में रासायनिक ऊर्जा धर्मान्तरित द्वारा उत्प्रेरित है. मानव कोशिकाओं luciferase व्यक्त (नीचे देखें) केवल luciferase व्यक्त luciferin सब्सट्रेट की उपस्थिति में प्रकाश emitting में सक्षम कोशिकाओं के साथ, संशोधित किया जा सकता है. जानवरों से कम से कम पृष्ठभूमि luminescence मेजबान luciferin के साथ इलाज किया, ऐसी है कि वहाँ luciferase संशोधित ट्यूमर कोशिकाओं से luminescence उत्सर्जन का पता लगाने, ट्यूमर के विकास और vivo में उपचार के लिए प्रतिक्रिया के बेहद संवेदनशील निगरानी की अनुमति के लिए एक बहुत अनुकूल संकेत से शोर अनुपात है. इसके अलावा, luciferase और अपने सब्सट्रेट, luciferin, स्तनधारी कोशिकाओं के लिए गैर विषैले होना दिखाया गया है, और हम इसी असंशोधित कोशिकाओं luciferase रिश्तेदार व्यक्त की कोशिकाओं के बीच कोई कार्यात्मक अंतर मनाया. Luciferin आसानी से कोशिका झिल्ली और intraperitoneal के बाद रक्त मस्तिष्क बाधा (आईपी) या अंतःशिरा इंजेक्शन चूहों में (iv) पार, जिससे हर डिब्बे जिसमें luciferase संशोधित कोशिकाओं की इमेजिंग की अनुमति है. फोटोन और luciferase संशोधित कोशिकाओं से उत्सर्जित प्रकाश स्पेक्ट्रम के उत्सर्जन के स्तर के लिए चूहों और चूहों के रूप में छोटे अनुसंधान जानवरों के ऊतकों घुसना करने के लिए पर्याप्त है, और बाह्य कम प्रकाश इमेजिंग कैमरे के साथ पाया जा सकता है. bioluminescence इमेजिंग के noninvasive प्रकृति ट्यूमर के विकास और व्यक्तिगत पशु विषयों में उपचार के लिए प्रतिक्रिया के दोहराया निगरानी की अनुमति देता है. प्रत्यारोपित सेल स्रोतों stably जुगनू luciferase अभिव्यक्ति के लिए संशोधित किया जाना चाहिए. इस तरह सेल सूत्रों का कहना है, खरीदा जा सकता है या व्यक्तिगत lentivirus कि luciferase के विधान अभिव्यक्ति के लिए निर्माण किया गया है का उपयोग प्रयोगशालाओं में उत्पादित. हम दृढ़ता से प्लाज्मिड बजाय luciferase एन्कोडिंग lentivirus, के साथ संशोधित कोशिकाओं का उपयोग की सलाह देते हैं, vivo में है, जो मात्रात्मक luminescence इमेजिंग के लिए आवश्यक है में स्थिर luciferase के सेलुलर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए ट्यूमर बोझ में व्यक्ति पशु विषयों रहे हैं जो बार – बार के लिए परिवर्तन की सही संकेत प्रदान एक प्रयोग के दौरान imaged. BLI निगरानी. हम मात्रात्मक bioluminescence इमेजिंग (qBLI) साप्ताहिक 1x-2x आयोजित करने की सलाह देते हैं, एक ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद सप्ताह की शुरुआत. हमारे qBLI IVIS Lumina इमेजिंग स्टेशन (कैलिपर लाइफ साइंसेज) का उपयोग किया है, और हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि समान डेटा IVIS Lumina, 150 IVIS, या IVIS 200 इमेजिंग स्टेशन का उपयोग करने में प्राप्त कर रहे हैं. इमेजिंग के लिए तैयार करने में, चूहों intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से / Ketamine Xylazine और प्रशासित luciferin (डी Luciferin पोटेशियम नमक, 150 मिलीग्राम / किग्रा, कैलिपर लाइफ साइंसेज) के साथ एक साथ anesthetized चूहों के साथ इंजेक्शन के बाद 12 मिनट imaged हैं. luciferin की फार्माकोकाइनेटिक्स से संकेत मिलता है कि प्रशासन के बीच समयluciferin और सेल luminescence के निर्धारण के tration luciferin के 10-15 मिनट के बाद इंजेक्शन के बीच हो सकता है, क्रम में अधिकतम luminescence उत्सर्जन और पता लगाने की सबसे बड़ी संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए चाहिए. 10-15 मिनट का समय अंतराल के भीतर चयनित समय की लंबाई के रूप में जानवरों है कि imaged किया जा रहा है के बीच निरंतर बनाए रखा जाना चाहिए. यह अत्यंत महत्वपूर्ण है luciferin और प्राप्त करने के BLI रीडिंग के इंजेक्शन के बीच समय की लंबाई में निरंतरता बनाए रखने के लिए. हित के संकेत के intracranial क्षेत्र को शामिल क्षेत्र जहाँ रहते हैं छवि (चित्रा 2) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिभाषित कर रहे हैं, और कुल photons/s/sr/cm2 (steradian प्रति दूसरा प्रति वर्ग सेमी प्रति फोटॉनों) (वीडियो देखें) दर्ज कर रहे हैं. डेटा विश्लेषण. जबकि ट्यूमर के विकास और चिकित्सा प्रतिक्रिया अलग – अलग जानवरों में निगरानी कर रहे हैं, हम अत्यधिक ट्यूमर प्रतिक्रिया के बारे में निष्कर्ष के सांख्यिकीय निश्चितता बढ़ाने के लिए कम से कम 8 के उपचार समूहों की सिफारिश, या उसके अभाव उपचार के लिए. पेश qBLI परिणाम के संबंध के साथ, luminescence रीडिंग प्रत्येक माउस luminescence विभाजित करके सामान्यीकृत मूल्यों को परिवर्तित कर रहे हैं, के दौरान प्राप्त की और अपनी इसी अधिकतम pretreatment 6,7 पढ़ने luminescence के साथ चिकित्सकीय आहार के पूरा होने के बाद,. अस्तित्व विश्लेषण के लिए, Kaplan-Meier 8 अनुमानक का प्रयोग किया जाता है, और जिसमें से अस्तित्व घटता उत्पन्न कर रहे हैं, और बीच का अस्तित्व मान निर्धारित है. अस्तित्व घटता के बीच अंतर एक लॉग – रैंक 9 परीक्षण का उपयोग करने के लिए तुलना कर रहे हैं. और इलाज ट्यूमर के बाद के विश्लेषण के लिए मस्तिष्क के रिट्रीवल. जानवर इच्छामृत्यु पर, माउस के मस्तिष्क जल्दी हो सकता है (वीडियो देखें) excised चाहिए, और या तो ट्यूमर आकारिकी और immunohistochemistry के बाद के विश्लेषण के लिए formalin में रखा है, या अक्टूबर में नमूना ठंड के लिए मुहिम शुरू की जाना चाहिए. 4. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3A में दिखाए गए उदाहरण में, intracranial ट्यूमर सेल इंजेक्शन प्राप्त चूहों intracranial luminescence के लिए निगरानी की गई जब तक लगातार मतलब luminescence मूल्यों प्रगतिशील ट्यूमर के विकास का संकेत है, और जिस पर समय थेरेपी (34 दिन में शुरू किया गया था ग्रे तीर शुरुआत: erlotinib के 150 मिलीग्राम दैनिक प्रशासित जब तक आवश्यक इच्छामृत्यु / किग्रा). प्रत्येक माउस के लिए luminescence मूल्यों चिकित्सा शुरू करने के समय पर 1 के एक normalized मूल्य के लिए सेट कर रहे हैं, प्रत्येक अपनी अंतिम pretreatment इमेजिंग मूल्य सामान्यीकृत माउस के लिए बाद luminescence रीडिंग के साथ,. एक उदाहरण के रूप में, एक अंतिम पूर्व उपचार x 10 2.0 7 फोटॉनों / सेक 34 दिन में luminescence जिसका 6.0 करने के लिए बढ़ था luminescence पढ़ने के साथ एक माउस x 10 फोटॉनों 7 / 38 दिन में सेक, एक दिन में 38 सामान्यीकृत luminescence मूल्य होगा 3.0 के. सामान्यीकृत bioluminescence और नियंत्रण और उपचार समूहों के लिए इसी मानक त्रुटि मतलब प्रत्येक इमेजिंग समय बिंदु के लिए प्लॉट किए जाते हैं. इस उदाहरण में, मतलब सामान्यीकृत luminescence में एक महत्वपूर्ण अंतर पहली इमेजिंग चिकित्सा की दीक्षा (38 दिन) के बाद समय बिंदु पर स्पष्ट मतलब समूह बाद में समय बिंदुओं पर आगे बढ़ाने के दिखा luminescence में अंतर के साथ है. ज्यादातर मामलों में, चिकित्सा, के रूप में qBLI संकेत द्वारा, विरोधी ट्यूमर गतिविधि के साथ अस्तित्व में इसी महत्वपूर्ण अंतर है (यानी, पी <0.05) द्वारा है, मामले के रूप में यहाँ है (चित्रा 3B). 3C और 3 डी शो आसन्न hematoxylin और eosin पैनलों और माउस मस्तिष्क के विरोधी EGFR दाग वर्गों इच्छामृत्यु के समय पर प्राप्त formalin और बाद आयल एम्बेडिंग में सेक्शनिंग लिए resected मस्तिष्क की नियुक्ति के बाद. चित्रा 1 intracranial इंजेक्शन त्रुटियों के संकेत.. ए) Exophytic (extracranial) ट्यूमर के विकास (लाल वृत्त) बहुत बड़ी है एक इंजेक्शन की मात्रा, अवशिष्ट सेल सिरिंज के लिए संलग्न निलंबन के कारण हो सकता है, या सिरिंज ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्शन के बाद बहुत जल्दी वापस लेने से. बी) के ventricles में ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्शन रीढ़ की हड्डी ट्यूमर का प्रसार (सही करने के लिए माउस) का कारण, अच्छी तरह से इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं के विपरीत में कर सकते हैं, संकेत इंजेक्शन साइट (बाईं ओर माउस) के लिए जिसके लिए स्थानीयकृत रहता है. चित्रा 2. एक चिकित्सा प्रतिक्रिया प्रयोग के नियंत्रण से प्रतिनिधि चूहों के लिए हीट नक्शा bioluminescence तीव्रता के छवि अभ्यावेदन (बाएं) और उपचार समूहों (दाएं) . लिविंग छवि सॉफ्टवेयर करने के लिए ब्याज के क्षेत्रों (लाल हलकों) को परिभाषित करने के लिए सेट किया जा सकता है, या साधन ऑपरेटरों हित के क्षेत्रों में मैन्युअल रूप से परिभाषित कर सकते हैं. जैसे आंकड़ा निर्माण के लिए इन छवियों का उपयोग करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि साधन ऑपरेटर गर्मी नक्शा एक ही bioluminescence गर्मी नक्शे श्रेणी (आंकड़े के ऊपरी भाग) का उपयोग करते हुए, छवियों पशु विषयों के बीच bioluminescence अंतर की हद तक के दृश्य प्रतिनिधित्व प्रदान से पता चलता है. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alटी = / "चित्रा 3"> चित्रा 3 bioluminescence, अस्तित्व, और एक प्रयोग है जिसमें चिकित्सीय प्रतिक्रिया स्पष्ट है से ट्यूमर के ऊतक विश्लेषण . ए) नियंत्रण और इलाज के समूह के चूहों के लिए मतलब bioluminescence मानक त्रुटि के साथ, रीडिंग के प्लॉट प्रत्येक इमेजिंग बिंदु के लिए संकेत दिया. बी) लॉग – रैंक 7 परीक्षण के उपयोग के माध्यम से एक ही चूहों के लिए जीवन रक्षा की साजिश, पी मूल्य निर्धारित. ट्यूमर के साथ सी) एच एंड ई माउस मस्तिष्क के दाग अनुभाग. डी) EGFR दाग अनुभाग. पैनल सी और डी, क्रमशः पैनल ट्यूमर शमन प्रोटीन PTEN के लिए नकारात्मक धुंधला दिखाने ई के साथ, से ई और एफ) संकेत क्षेत्रों के magnifications.

Discussion

Orthotopic (intracranial) ब्रेन ट्यूमर xenograft स्थापना मॉडलिंग सीएनएस कैंसर के लिए एक उचित ¹⁰ microenvironment के लिए चिकित्सकीय प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किया जाना प्रदान करता है. मॉडलिंग के इस प्रकार के अतिरिक्त मस्तिष्क और मस्तिष्क ट्यूमर है, जो गंभीर रूप से निर्धारित करता है कि एक प्रयोगात्मक एजेंट रोगियों में चिकित्सीय परीक्षण मूल्यांकन करने के लिए उन्नत किया जाना चाहिए करने के लिए महत्वपूर्ण है चिकित्सकीय उपयोग के बारे में जानकारी प्रदान करता है. क्योंकि intracranial xenograft ट्यूमर की राशि सीधे कैलिपरस द्वारा जैसे नहीं हो सकता है, मापा जा सकता है, intracranial ट्यूमर के विकास और उपचार के लिए प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य निगरानी गैर इनवेसिव इमेजिंग की आवश्यकता है, प्रयोगों के लिए सबसे अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण जिसका प्राथमिक उद्देश्य के रूप में हमारे bioluminescence इमेजिंग अनुभव संकेत के साथ उपचार के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया की हद तक का आकलन है. जब bioluminescence इमेजिंग के परिणाम जानवर विषय अस्तित्व विश्लेषण के साथ संयुक्त कर रहे हैं, दो डेटा सेट प्रयोगात्मक चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली और विश्वसनीय दृष्टिकोण प्रदान करते हैं.

अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि intracranial मस्तिष्क ट्यूमर xenografts euthanized पशु विषयों से harvested रहे हैं क्रम में करने के लिए चिकित्सा के शब्द के भागों और आणविक प्रभाव का आकलन, और इस के लिए हम इच्छामृत्यु के समय में resected मस्तिष्क के बाद के विश्लेषण के लिए संरक्षण के साथ पूरे दिमाग लकीर, पसंद करते हैं.

जबकि पूर्ववर्ती प्रस्तुति ब्रेन ट्यूमर अनुसंधान के लिए विशिष्ट किया गया है, अवधारणाओं निश्चित रूप से अन्य मानव कैंसर है कि rodents में orthotopic मॉडलिंग करने के लिए उत्तरदायी हैं generalizeable.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Disposable Scapels		Feather	2975	No.21
Heating Pad		Dunlap	HP950
Gauze		Fisher Scientific	22028563
Cotton Swabs		Fisher Scientific	23-400-100
2% Chlorhexidine		Fisher Scientific	NC9756995
3% Hydrogen Peroxide		Fisher Scientific	H312P-4
25g Needle		Becton Dickinson	305122
10ul Hamilton Sharp Microsyringe		Hamilton	20734
Skin Stapler and Staples		Stoelting	59020
Stereotaxic Frame		Stoeling	51725
Living Image Software		Caliper Life Science
D-luciferin		Gold Biotechnology	LUCK-1G	Potassium Salt
Xenogen Lumina		Caliper Life Science