सेल Electrofusion प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ visualized
Summary
इस वीडियो में हम कोशिकाओं के कुशल electrofusion प्रदर्शन<em> इन विट्रो में</em> संशोधित पालन electroporation और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ जुड़े कोशिकाओं दृश्य के बाद पता लगाने के विधि का उपयोग कर के माध्यम से.
Abstract
सेल electrofusion एक सुरक्षित, गैर वायरल और गैर रासायनिक विधि है कि मानव उपचार के लिए संकर कोशिकाओं की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Electrofusion कम कोशिकाओं है कि निकट संपर्क में हैं उच्च वोल्टेज बिजली के दालों के आवेदन शामिल है. संक्षेप में, उच्च वोल्टेज बिजली के दालों के आवेदन सेल प्लाज्मा झिल्ली की अस्थिरता का कारण बनता है. अस्थिर झिल्ली अलग अणुओं के लिए और अधिक पारगम्य और भी किसी भी पड़ोसी अस्थिर झिल्ली के साथ विलय करने के लिए प्रवण हैं. Electrofusion इस प्रकार बहुत अलग कोशिकाओं के एक गैर विशिष्ट संलयन प्राप्त करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है<em> इन विट्रो में</em>. आदेश में संलयन, कोशिका झिल्ली, बिजली के क्षेत्र से अस्थिर प्राप्त करने के लिए, एक करीबी संपर्क में अपनी लिपिड bilayers के विलय और फलस्वरूप उनके cytoplasm की अनुमति चाहिए. इस वीडियो में, हम कोशिकाओं के कुशल electrofusion प्रदर्शन<em> इन विट्रो में</em> संशोधित पालन विधि के माध्यम से. इस विधि में, कोशिकाओं को अच्छी तरह से सतह पर केवल थोड़ा देते हैं अनुमति दी जाती है, इसलिए है कि मध्यम और विमर्श किया जा सकता है कोशिकाओं को अभी भी उनके गोलाकार आकृति के संरक्षण. फ्यूजन दृश्य अलग फ्लोरोसेंट सेल tracker रंगों के साथ कोशिकाओं के cytoplasm के पूर्व लेबलिंग द्वारा मूल्यांकन है, कोशिकाओं के आधा नारंगी CMRA और हरी CMFDA के साथ दूसरे आधे के साथ लेबल रहे हैं. फ्यूजन उपज dually फ्लोरोसेंट सभी दो से गुणा कोशिकाओं की संख्या के साथ विभाजित कोशिकाओं की संख्या के रूप में निर्धारित किया जाता है.
Protocol
Discussion
कोशिका झिल्ली की क्षमता गैर विशेष रूप से, उदाहरण के लिए, बाह्य बिजली क्षेत्र द्वारा, फ्यूज, जैव प्रौद्योगिकी और जीव विज्ञान में चिकित्सा अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसे nonspecific संलयन अत्यधिक मूल्यवान संकर कोशिकाओं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में अपने उत्पादों के उत्पादन में सक्षम बनाता है, और संलयन [2] के मौलिक तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान करता है है. Electrofusion एक संभावित बहुत प्रभावी तरीका है के बाद से यह ठीक से कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए समायोजित किया जा सकता है. Electrofusion हासिल की है जब करीब शारीरिक संपर्क में कोशिकाओं को उनके fusogenic राज्य में लाया जाता है (संलयन करने के लिए प्रवण) उच्च वोल्टेज बिजली के दालों के माध्यम से. electrofusion की दक्षता विभिन्न मापदंडों electrofusion प्रक्रिया के दो भागों को प्रभावित पर निर्भर करता है. Electrofusion प्रक्रिया का पहला भाग कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ शारीरिक संपर्क की उपलब्धि है, जो अलग अलग तरीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है [3-8]. पालन विधि (संगम के लिए बढ़ रही कोशिकाओं) अनायास स्थापित कोशिकाओं के बीच बड़े क्षेत्रों में सेल संपर्कों के कारण कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, यह कई नाभिक के साथ बहुत बड़ी इनकार कोशिकाओं का उत्पादन. हम संशोधित पालन विधि का उपयोग कर रहे हैं, जहां छोटे (2 से 5 नाभिक के साथ) कोशिकाओं है, जो और अधिक जीवित होने की संभावना है और पैदा प्राप्त कर रहे हैं (चित्रा 1). कोशिकाओं के बीच संपर्क भी कोशिकाओं की आसमाटिक सूजन से लाभ, आसमाटिक [9] प्रयोग में इस्तेमाल किया उपचार के कारण. Electrofusion प्रक्रिया का दूसरा भाग कोशिका झिल्ली के fusogenic राज्य की उपलब्धि है. Fusogenic राज्य झिल्ली के electropermeabilized राज्य (कोशिकाओं अणुओं है कि सामान्य रूप से बरकरार झिल्ली के माध्यम से पारित नहीं कर सकते permeabilized गैर – विशेष रूप से कर रहे हैं) के साथ अच्छी तरह से संबद्ध है और बिजली दालों (आयाम, लंबाई, संख्या, और आवृत्ति) का एक ही पैरामीटर द्वारा नियंत्रित [10] . बिजली के इष्टतम electroporation के लिए आवश्यक मापदंडों के मूल्यों [1] electrofusion और विभिन्न कोशिकाओं के बीच अलग और कोशिकाओं के आकार और उनके जैविक गुणों पर निर्भर करती है. बिजली पैरामीटर इस प्रकार के लिए विभिन्न सेल लाइनों, जो संलयन भागीदार के रूप में उपयोग किया जाता है, संलयन प्राप्त के लिए अनुकूलित किया जा जरूरत है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी (परियोजना J2-9764 और P2-0249 कार्यक्रम) द्वारा समर्थित किया गया था. इस वीडियो "electroporation आधारित प्रौद्योगिकी और उपचार" वैज्ञानिक कार्यशाला और स्नातकोत्तर कोर्स, Ljubljana, स्लोवेनिया के विश्वविद्यालय में इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग के संकाय द्वारा आयोजित के लिए पूरक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMRA | Reagent | Invitrogen | C34551 | Cytosolic fluorescent dye |
| CMFDA | Reagent | Invitrogen | C7025 | Cytosolic fluorescent dye |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM | Reagent | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s modified Eagle’s medium |
| Fetal calf serum | Reagent | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Reagent | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| KH2PO4 | Reagent | Merck | A124873 927 | |
| KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | 4248 | |
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaCl | Reagent | Fluka | 71382 | |
| KCl | Reagent | Merck | A154336 908 | |
| MgSO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| D-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| sucrose | Reagent | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| Electric pulse generator | Tool | Igea | Cliniporator VITAE | |
| Multiwell plate | Tool | TPP | 92424 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tool | TPP | 91050 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tool | TPP | 91015 | |
| 25 cm2 culture flask | Tool | TPP | 90026 | |
| Electrodes | Tool | Custom made | Pt/Ir |
References
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