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Biology

सेल Electrofusion प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ visualized

doi: 10.3791/1991 Published: July 1, 2010

Summary

इस वीडियो में हम कोशिकाओं के कुशल electrofusion प्रदर्शन

Abstract

सेल electrofusion एक सुरक्षित, गैर वायरल और गैर रासायनिक विधि है कि मानव उपचार के लिए संकर कोशिकाओं की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Electrofusion कम कोशिकाओं है कि निकट संपर्क में हैं उच्च वोल्टेज बिजली के दालों के आवेदन शामिल है. संक्षेप में, उच्च वोल्टेज बिजली के दालों के आवेदन सेल प्लाज्मा झिल्ली की अस्थिरता का कारण बनता है. अस्थिर झिल्ली अलग अणुओं के लिए और अधिक पारगम्य और भी किसी भी पड़ोसी अस्थिर झिल्ली के साथ विलय करने के लिए प्रवण हैं. Electrofusion इस प्रकार बहुत अलग कोशिकाओं के एक गैर विशिष्ट संलयन प्राप्त करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है

Protocol

I. सेल trackers CMFDA और CMRA के साथ लोड हो रहा है कोशिकाओं

  1. प्रयोगों माउस मेलेनोमा सेल लाइन (B16-F1) के पहले तैयार की कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया. कक्ष में दो अलग 25 2 सेमी संस्कृति बोतल (TPP, ZDA) DMEM संस्कृति माध्यम में 70-80% संगम (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.15 मिलीग्राम / एमएल एल glutamine, 16 मिलीग्राम के साथ पूरक करने के लिए बड़े हो रहे हैं / मिलीलीटर gentamicin (सिग्मा Aldrich, जर्मनी से सभी), 200 इकाइयों / एमएल crystacillin (Pliva, क्रोएशिया), और 37 पर 5% सीओ 2 में incubated डिग्री सेल्सियस
  2. डाई के 50 μg मूल में 10.76 μl और DMSO (सिग्मा Aldrich, जर्मनी) के 9 μl (ग्रीन CMFDA और ऑरेंज CMRA के लिए, क्रमशः) जोड़कर दो सेल trackers की 10 मिमी शेयर समाधान (Invitrogen, संयुक्त राज्य अमरीका) तैयार Invitrogen शीशी. शेयर समाधान 4 ° कुछ महीनों के लिए सी में एक रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है. शुरू करने से पहले प्रयोग, समाधान गर्म जब तक DMSO के क्रिस्टल को भंग.
  3. तैयार बिकारबोनिट मुक्त क्रेब्स Hepes बफर (130 मिमी NaCl, 4.7 मिमी KCl, 1.2 मिमी MgSO 4, 1.2 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 11.7 मिमी डी ग्लूकोज, 1.3 मिमी CaCl 2, 10 मिमी HEPES, 7.4 पीएच). दो में 15 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों अलग बिकारबोनिट मुक्त क्रेब्स - Hepes बफर के 3 मिलीलीटर में प्रत्येक शेयर समाधान के 2.1 μl मिश्रण (10 मिमी CMFDA या CMRA, क्रमशः). यह एक "लोड हो रहा है समाधान" लगभग 7 सुक्ष्ममापी CMFDA (या CMRA) युक्त पैदावार.
  4. कोशिकाओं बिकारबोनिट मुक्त क्रेब्स - Hepes बफर के साथ दो बार और फिर कुल्ला बोतल में समाधान लोड हो रहा है सम्मिलित है. 5% सीओ 2 में 37 पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस के दौरान इस पहली ऊष्मायन अभिकर्मकों कोशिका झिल्ली के माध्यम से आसानी से गुजरती हैं, लेकिन एक बार सेल के अंदर, अभिकर्मकों सेल impermeant फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया उत्पादों में तब्दील हो रहे हैं.
  5. पहली ऊष्मायन के बाद कुल्ला, और 37 में 5% सीओ 2 में एक और दो ​​घंटे के लिए मध्यम संस्कृति के साथ कोशिकाओं को सेते की डिग्री सेल्सियस
  6. दोनों बोतल में कोशिकाओं Trypsinize (CMFDA और CMRA के साथ भरी हुई) और लाल और हरे रंग की कोशिकाओं को एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 1:1 के अनुपात (TPP, ZDA) में एक साथ मिश्रण. 5 x 10 6 DMEM मध्यम के साथ कमजोर पड़ने से या अपकेंद्रित्र के साथ एकाग्रता द्वारा कोशिकाओं / मिलीलीटर सेल एकाग्रता समायोजित करें. 24 multiwell प्लेट (TPP, ZDA) के प्रत्येक अच्छी तरह से में 20 सेल निलंबन के μl ड्रॉप प्लेस. 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए अनुमति देने के लिए उन्हें थोड़ा अच्छी तरह से सतह करने के लिए संलग्न करने के लिए और सेल संपर्क स्थापित सेते हैं.

द्वितीय. Electrofusion

  1. Isoosomolar पोटेशियम फॉस्फेट बफर तैयार (10 KH2PO4 मिमी, 10 मिमी K-2 HPO 4, 1mm 2 MgCl, 250 मिमी sucrose) और hypoosmolar पोटेशियम फॉस्फेट बफर (10 KH2PO4 मिमी, 10 मिमी K-2 HPO 4, 1mm 2 MgCl, 75 मिमी sucrose) .
  2. कोशिकाओं इलेक्ट्रोड के साथ खुर्दबीन चरण, स्थिति, पर अच्छी तरह से नीचे multiwell प्लेस और उन्हें पल्स जनरेटर कनेक्ट.
  3. Isoosomolar पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें. Hypoosmolar पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 350 μl जोड़ें क्रम में सेल सूजन प्रेरित है. बफर इलेक्ट्रोड को कवर किया जाना चाहिए.
  4. बिजली दालों को लागू करने से पहले 2 मिनट के लिए hypoosmolar बफर में कोशिकाओं को छोड़ दें. कोशिकाओं के आंतरिक और बाहरी के बीच आसमाटिक असंतुलन की वजह से कोशिकाओं में पानी के अणुओं के इस समय बाढ़ के दौरान सेल की मात्रा की वृद्धि के कारण. इलेक्ट्रिक दालों जब कोशिकाओं को अपनी अधिकतम मात्रा करीब हैं विनियामक मात्रा कम शुरू होने से पहले लागू किया जाना चाहिए,.
  5. इष्टतम electrofusion प्राप्त करने और बनाए रखने के सेल व्यवहार्यता, बिजली के दालों के इष्टतम मापदंडों इस्तेमाल किया जाना चाहिए. ये सेल [1] प्रयोग किया जाता लाइन पर निर्भर हैं. इस प्रयोग में 8 आयताकार दालों (1 हर्ट्ज पर 100 μs की अवधि के साथ प्रत्येक) की एक ट्रेन के प्रत्येक नमूने के लिए लागू है, electroporation डिवाइस (हमारे मामले Cliniporator, Igea, इटली में) का उपयोग. दालों 0.8 मिमी व्यास और 5 मिमी उन दोनों के बीच दूरी के साथ दो समानांतर / पं. Ir तार इलेक्ट्रोड के लिए वितरित कर रहे हैं, अच्छी तरह से नियंत्रण के लिए छोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से में इलेक्ट्रोड के बीच लगभग 1200 वी / सेमी की एक बिजली के क्षेत्र बनाने.
  6. पल्स प्रसव के बाद 10 मिनट के लिए undisturbed कोशिकाओं छोड़ो. संलयन फ्लोरोसेंट और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उपज का निर्धारण करते हैं.

III. छवि के अधिग्रहण और संलयन उपज का निर्धारण

  1. कोशिकाओं एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (हमारे मामले Zeiss AxioVert 200, Zeiss, जर्मनी में) एक उद्देश्य (x20) और एक ठंडा सीसीडी कैमरा (1280 VisiCam, Visitron, जर्मनी) के साथ सुसज्जित का उपयोग करते हुए मनाया जाता है. छवियों MetaMorph 7.1.1 (आण्विक डिवाइसेज, संयुक्त राज्य अमरीका) में प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन अन्य समान अधिग्रहण सॉफ्टवेयर भी इस्तेमाल किया जा सकता है. CMFDA 492 एनएम (विचित्र चतुर्थ, Visitron, जर्मनी) monochromator और CMRA के साथ 548 एनएम उत्साहित है. CMFDA और CMRA के प्रतिदीप्ति दो उत्सर्जन फिल्टर, एक 535 एनएम पर केंद्रित (HQ535/30m CMFDA के लिए) और 510 एनएम अन्य केंद्रित का उपयोग कर (D605/55m सी के लिए अधिग्रहण कर लिया हैMRA, दोनों Chroma, संयुक्त राज्य अमरीका). dichroic दर्पण (Q515LP) का उपयोग चैनल पार बात को रोका.
  2. प्रत्येक कुएं में पांच बेतरतीब ढंग से चुने हुए क्षेत्रों के लिए तीन छवियों (चरण विपरीत, लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति) मोल. प्रत्येक छवि triplet से तीन चैनल छवियों बनाएँ. ऐसी छवि में fluorescing cytoplasm कोशिका झिल्ली के साथ एक साथ देखा जा सकता है. इनकार कोशिकाओं को इस तरह आसानी से [चित्रा 1] निर्धारित किया है.
  3. प्रत्येक तीन चैनल की छवि में कोशिकाओं के सभी तीन प्रकार (लाल, हरे और dually फ्लोरोसेंट) गिन लो. प्रत्येक छवि में सभी कोशिकाओं की संख्या के साथ dually फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके dually फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित है. फ्यूजन उपज dually फ्लोरोसेंट 2 से गुणा कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया गया है के बाद से इनकार कोशिकाओं के आधे नहीं पता चला रहे हैं (जब एक ही रंग फ्यूज की कोशिकाओं).

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 electrofusion बाद B16F1 कोशिकाओं के तीन चैनल माइक्रोस्कोपी छवि: चरण के विपरीत, CMRA (548 एनएम पर उत्तेजना) प्रतिदीप्ति और CMFDA प्रतिदीप्ति (492 एनएम पर उत्तेजना), उद्देश्य 20x बढ़ाई.

Discussion

कोशिका झिल्ली की क्षमता गैर विशेष रूप से, उदाहरण के लिए, बाह्य बिजली क्षेत्र द्वारा, फ्यूज, जैव प्रौद्योगिकी और जीव विज्ञान में चिकित्सा अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसे nonspecific संलयन अत्यधिक मूल्यवान संकर कोशिकाओं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में अपने उत्पादों के उत्पादन में सक्षम बनाता है, और संलयन [2] के मौलिक तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान करता है है. Electrofusion एक संभावित बहुत प्रभावी तरीका है के बाद से यह ठीक से कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए समायोजित किया जा सकता है. Electrofusion हासिल की है जब करीब शारीरिक संपर्क में कोशिकाओं को उनके fusogenic राज्य में लाया जाता है (संलयन करने के लिए प्रवण) उच्च वोल्टेज बिजली के दालों के माध्यम से. electrofusion की दक्षता विभिन्न मापदंडों electrofusion प्रक्रिया के दो भागों को प्रभावित पर निर्भर करता है. Electrofusion प्रक्रिया का पहला भाग कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ शारीरिक संपर्क की उपलब्धि है, जो अलग अलग तरीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है [3-8]. पालन ​​विधि (संगम के लिए बढ़ रही कोशिकाओं) अनायास स्थापित कोशिकाओं के बीच बड़े क्षेत्रों में सेल संपर्कों के कारण कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, यह कई नाभिक के साथ बहुत बड़ी इनकार कोशिकाओं का उत्पादन. हम संशोधित पालन विधि का उपयोग कर रहे हैं, जहां छोटे (2 से 5 नाभिक के साथ) कोशिकाओं है, जो और अधिक जीवित होने की संभावना है और पैदा प्राप्त कर रहे हैं (चित्रा 1). कोशिकाओं के बीच संपर्क भी कोशिकाओं की आसमाटिक सूजन से लाभ, आसमाटिक [9] प्रयोग में इस्तेमाल किया उपचार के कारण. Electrofusion प्रक्रिया का दूसरा भाग कोशिका झिल्ली के fusogenic राज्य की उपलब्धि है. Fusogenic राज्य झिल्ली के electropermeabilized राज्य (कोशिकाओं अणुओं है कि सामान्य रूप से बरकरार झिल्ली के माध्यम से पारित नहीं कर सकते permeabilized गैर - विशेष रूप से कर रहे हैं) के साथ अच्छी तरह से संबद्ध है और बिजली दालों (आयाम, लंबाई, संख्या, और आवृत्ति) का एक ही पैरामीटर द्वारा नियंत्रित [10] . बिजली के इष्टतम electroporation के लिए आवश्यक मापदंडों के मूल्यों [1] electrofusion और विभिन्न कोशिकाओं के बीच अलग और कोशिकाओं के आकार और उनके जैविक गुणों पर निर्भर करती है. बिजली पैरामीटर इस प्रकार के लिए विभिन्न सेल लाइनों, जो संलयन भागीदार के रूप में उपयोग किया जाता है, संलयन प्राप्त के लिए अनुकूलित किया जा जरूरत है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी (परियोजना J2-9764 और P2-0249 कार्यक्रम) द्वारा समर्थित किया गया था. इस वीडियो "electroporation आधारित प्रौद्योगिकी और उपचार" वैज्ञानिक कार्यशाला और स्नातकोत्तर कोर्स, Ljubljana, स्लोवेनिया के विश्वविद्यालय में इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग के संकाय द्वारा आयोजित के लिए पूरक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
CMRA Reagent Invitrogen C34551 Cytosolic fluorescent dye
CMFDA Reagent Invitrogen C7025 Cytosolic fluorescent dye
DMSO Reagent Sigma-Aldrich D2650
DMEM Reagent Sigma-Aldrich D5671 Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum Reagent Sigma-Aldrich F4135
L-glutamine Reagent Sigma-Aldrich G7513
crystacillin Reagent Pliva 625110 antibiotic
gentamicin Reagent Sigma-Aldrich G1397 antibiotic
Hepes Reagent Sigma-Aldrich H0887
KH2PO4 Reagent Merck & Co., Inc. A124873 927
KH2PO4 Reagent Sigma-Aldrich 4248
MgCl2 Reagent Sigma-Aldrich M-8266
NaCl Reagent Fluka 71382
KCl Reagent Merck & Co., Inc. A154336 908
MgSO4 Reagent Sigma-Aldrich M2643
D-glucose Reagent Sigma-Aldrich G8270
CaCl2 Reagent Sigma-Aldrich C4901
sucrose Reagent Sigma-Aldrich 16104
Electric pulse generator Tool IGEA Cliniporator VITAE
Multiwell plate Tool Techno Plastic Products 92424
50 ml centrifuge tube Tool Techno Plastic Products 91050
15 ml centrifuge tube Tool Techno Plastic Products 91015
25 cm2 culture flask Tool Techno Plastic Products 90026
Electrodes Tool Custom Made Pt/Ir

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References

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Trontelj, K., Ušaj, M., Miklavčič, D. Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e1991, doi:10.3791/1991 (2010).More

Trontelj, K., Ušaj, M., Miklavčič, D. Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e1991, doi:10.3791/1991 (2010).

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